СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ В НЕПРЕРЫВНОМ РЕЖИМЕ Российский патент 1997 года по МПК C12P7/48 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способу получения лимонной кислоты при культивировании гриба Asp.niger на питательной среде из мелассы, и может быть использовано в пищевой промышленности, медицине, фармакологии и т.д.

Существующее на сегодняшний день производство лимонной кислоты микробиологическим способом основано на периодическом культивировании продуцента на предварительно подготовленной к ферментации мелассе.

Однако периодический способ производства из-за невысокой производительности и трудоемкости процесса мало эффективен с экономической точки зрения. Кроме того, эффективность производства лимонной кислоты во многом зависит от стадии подготовки мелассы к ферментации, в частности от освобождения мелассы от избытка железа и других тяжелых металлов. В производстве лимонной кислоты для этой цели мелассу обрабатывают гексацианоферратом калия К₄[Fe(CN)₆] (ЖКС) и другими комплексообразователями. При таком способе подготовки мелассы к ферментации в растворе остаются значительные количества свободных ионов ферроцианида. Для снятия их токсического действия (нейтрализации) обычно используют соли железа или гидросульфит натрия, что требует строгого контроля за содержанием ионов железа и серы, т.к. избыток существенно снижает выход лимонной кислоты. Кроме того, наличие свободного ферроцианида приводит к поступлению цианидов в биомассу гриба, что ограничивает варианты решения проблем по утилизации отходов с высоким содержанием биологически активных веществ.

Известен способ получения лимонной кислоты при культивировании гриба А. niger в периодическом режиме на мелассной питательной среде предварительно обработанной K₄[Fe(CN)>₆] по А.С. N 813968 СССР, С 12 Р 7/48.

Недостатком указанного способа является то, что производство лимонной кислоты осуществляют в периодическом режиме, что существенно снижает производительность процесса. Кроме того, обработка мелассы ЖСК приводит к наличию свободного ферроцианида в среде, что сопровождается поступлением цианидов в биомассу мицелия и жидкостные потоки после отделения лимонной кислоты.

Наиболее близким аналогом по своей технической сущности является способ получения лимонной кислоты в непрерывном режиме в две стадии на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода сахар по патенту Fr С 12 Р 7/48, N 2503736, 1982. Недостатком изложенного способа наряду с невысокой продуктивностью процесса является высокая стоимость сырья (сахара), что существенно снижает экономическую эффективность процесса.

Технический результат предлагаемого способа заключается в повышении эффективности ферментируемости мелассы в лимонную кислоту и повышении производства лимонной кислоты за счет создания непрерывного способа ее производства.

Повышение ферментируемости мелассы достигается путем сорбционной очистки мелассы на цеолите. При этом достигается освобождение мелассы от избытка тяжелых металлов, особенно железа, а также хлоридов, сульфатов и коллоидов до величины, необходимой для поддержания основных биологических функций гриба, при одновременном обогащении мелассы микроэлементами, стимулирующими кислотообразование.

Для сорбционной очистки мелассы на клиноптилолите разбавленный водопроводной водой до требуемой концентрации раствор мелассы пропускают с определенной скоростью через колонку, заполненную фильтрующей загрузкой-клиноптилолитом зернением 0,2 2,0 мм.

Клиноптилолит цеолит осадочного происхождения, основой цеолитового каркаса являются тетраэды SiO₄ и AlO₄. Он относится к группе цеолитов с трехмерным каркасом и является выраженным микропористым адсорбентом.

Оптимальная скорость фильтрования мелассы через клиноптилолитовый фильтр в пределах от 6 до 10 м/ч. Объем пропущенной жидкости может колебаться в зависимости от состава мелассы от 10 до 200 объемов на 1 объем клиноптилолита.

Результаты сорбционной очистки мелассы на клиноптилолитовом фильтре представлены в табл. 1, из которых видно, что клиноптилолит лучше чем ЖКС удаляет избыток железа, кальция, меди, сульфат ионов и т.д.

Отработанную указанным способом мелассную среду после установления рН и стерилизации используют для культивирования гриба А.niger, которое, согласно изобретению, осуществляют в непрерывном режиме в две стадии.

Культивирование на первой стадии осуществляют при рН среды 6,0 6,8, при температуре 33^oС, скорости перемешивания среды 250 об/мин и подаче воздуха 1 1,5 л/л среды. Через 24 36 ч от начала культивирования после сформирования мицелия рН среды снижают до 2,5 3,0 путем подачи в ферментер 10%-ного раствора Н₂SO₄ или HCl. Резкое снижение рН среды после формирования мицелия способствует биосинтезу продуцентом преимущественно лимонной кислоты, так как в щелочной среде гриб А.niger интенсивно синтезирует щавелевую кислоту, а при рН 5 глюконовую. Кроме того, подщелачивание среды способствует частичной инактивации бактериальной и дрожжевой микрофлоры среды, подавляющей биосинтетическую активность гриба.

Затем, когда рост культуры-продуцента замедляется и начинается активный рост лимонной кислоты в среде, процесс переводят на непрерывный режим путем подачи в ферментер стерильной мелассной среды (очищенной на клиноптилолитовом фильтре) со скоростью разбавления среды (Д), равной 0,03 ч^-1 (табл.2). Перетекающая суспензия поступает во второй ферментер, культивирование на второй стадии осуществляют при температуре 31^oС, и при непрерывной или периодической подаче в среду определенных концентраций ПАВ (табл.3), индуцирующих экскрецию лимонной кислоты путем влияния на проницаемость клеток продуцента, со второго ферментера суспензия поступает в специальный сборник. Результаты, представленные в табл.3, показывают что наибольшее накопление лимонной кислоты имеет место при концентрациях ПАВ 0,001 0,01% При увеличении концентрации ПАВ выше 0,01% концентрация лимонной кислоты в среде снижается.

Таким образом, при производстве лимонной кислоты в указанном режиме достигается увеличение выработки лимонной кислоты по сравнению с контрольными вариантами (пример 1) выработка 3,86 г/ч, пример 7 выработка 7 г/ч) в среднем на 40 50% Кроме того, предлагаемый способ очистки мелассы предотвращает поступление цианидов в биомассу мицелия и жидкостные стоки, что позволяет использовать их в качестве биологически активных соединений в животноводстве.

Биосинтез лимонной кислоты в зависимости от времени изменения и величины рН представлен на чертеже, где 1 контроль (естественное изменение рН); 2 - снижение рН среды через 12 ч, 3 то же, через 24, 4, 36, 5, 48 ч.

Изобретение поясняется примерами реализации.

Пример 1 (контрольный периодический процесс, меласса обработана K₄[Fe(CN)₆]
Гриб Aspergillus niger ВСБ 228 культивировали периодическим способом в аппарате с рабочем объемом 10 л на мелласной питательной среде, обработанной K₄[Fe(CN)₆] (при концентрации 250 мг/л). Обработку проводили при температуре 80 90^oС. После установления рН 6,8 среду стерилизовали и использовали в процессе ферментации.

Режим ферментации. Меласса рН 6,8 содержала 8% редуцирующих веществ (РВ). Культивирование осуществляли при начальной температуре 33^oС в течение 48 ч. Затем при 31^oС, при скорости перемешивания 250 об/м и аэрации среды 1 м/мин/л среды. Содержание минеральных элементов в мелассе до и после обработки как показано в табл.1. Длительность ферментации 7 суток.

Концентрация лимонной кислоты в среде 65 г/л, производство лимонной кислоты 92,6 г/сут или 3,86 г/ч.

Пример 2. Гриб А.niger ВСБ-228 культивировали непрерывным способом на мелассной питательной среде после сорбционной очистки на клиноптилолитовом фильтре.

Режим подготовки мелассы к ферментации. Мелассу развели водопроводной водой до концентрации РВ 6 пропустили через колонку, заполненную клиноптилолитом со скоростью 8 м/ч, установили рН 6,8 и после стерилизации при температуре 100^oС в течение 45 м использовали в процессе ферментации. Ферментацию проводили в две стадии.

Режим ферментации. Культивирование гриба на первой стадии ферментации осуществляли в аппарате с рабочим объемом 10 л, при температуре 33^oС, первоначальном значении рН 6,8, скорости перемешивания среды 250 об/мин и аэрации 1 л/л среды в 1 мин. Через 48 ч от начала культивирования, после снижения интенсивности образования мицелиальной массы, процесс перевели на непрерывный режим путем подачи в ферментер свежей мелассной среды, очищенной на клиноптилолитном фильтре; со скоростью разбавления среды (Д) 0,03 ч^-1. Перетекающая суспензия с такой же скоростью поступала во второй ферментер (2-я стадия), где культивирование осуществляли при температуре 31^oС, аэрации среды 1 л/л среды в 1 мин и оборотах мешалки 250 об/мин. Длительность ферментации 5 суток. Концентрация лимонной кислоты в среде 30 г/л, производительность лимонной кислоты 216 г/сутки или 9 г/ч.

Таким образом, введение процесса производства лимонной кислоты в две стадии со скоростью разбавления среды 0,03 ч^-1 способствует повышению эффективности производства лимонной кислоты, что выражается в увеличении производства лимонной кислоты в 1 ч от 3,86 г в периодическом режиме до 9 г в непрерывном процессе.

Пример 3. Гриб А.niger ВСБ-228 культивировали непрерывным способом на мелассной питательной среде после сорбционной очистки на клиноптилолитовом фильтре.

Режим подготовки мелассы к ферментации: мелассу с содержанием РВ 6% пропускали через колонку, заполненную клиноптилолитом со скоростью 8 м/ч. После установления рН среды 6,8 мелассную среду стерилизовали и использовали в процессе ферментации. Содержание минеральных элементов в мелассе до и после обработки показано в табл.1.

Режим ферментации: культивирование гриба на первой ферментации осуществляли в аппарате с рабочим объемом 10 л на мелассной среде, содержащей 8% РВ, при температуре 33^oC, первоначальном значении рН 6,8, скорости перемешивания среды 250 об/мин и аэрации 1л/л среды. Через 24 ч от начала культивирования рН среды снизили до 2,5 путем подачи в ферментер 10% H₂SO₄. После прекращения роста мицелия процесс перевели на непрерывный режим путем подачи в ферментер свежей мелассной среды: очищенной на клиноптилолитовом фильтре со скоростью разбавления среды (Д)-0,03 ч^-1. Перетекающая суспензия с такой же скоростью (Д-0,03 ч ^-1) поступала во второй ферментер (2-я стадия). Культивирование на второй стадии осуществляли при температуре -31^oC, аэрации 1 л/л среды в 1 мин, скорости перемешивания среды 250 об/мин и периодической подаче в среду 10 мг/л додецилсульфата натрия. Длительность ферментации 5 суток. Концентрация лимонной кислоты в среде 45 г/л, производство лимонной кислоты 324 г/сутки или 13,5 г/ч.

Таким образом, снижение рН среды до 2,5 после формирования мицелиальной массы на 1-й стадии ферментации и введение додецилсульфата натрия в среду на 2-й стадии ферментации существенно повышает эффективность процесса производства лимонной кислоты.

Пример 4. Культивирование гриба A.niger ВСБ-228 проводили непрерывным способом в две стадии по примеру 3. На 2-й стадии ферментации в аппарат подавали твин-40 в концентрации 20 мг/л. Длительность ферментации 5 суток. Концентрация лимонной кислоты в среде 43 г/л, производство лимонной кислоты-309 г/сутки или 12,9 г/ч.

Таким образом, введение оптимальных концентраций твин-40 на 2-ю стадию ферментации гриба, где происходит преимущественно биосинтез лимонной кислоты, существенно повышает эффективность процесса производства лимонной кислоты.

Пример 5. Культивирование гриба А.niger ВСБ-228 осуществляли непрерывным способом в две стадии по примеру 3. На 2-й стадии ферментации в аппарат подавали твин-80 в концентрации 20 мг/л. Длительность ферментации 5 суток. Концентрация лимонной кислоты в среде 45 г/л, производство лимонной кислоты 324,0 г/сутки или 13,5 г/ч.

Пример 6. Культивирование гриба А.niger ВСБ-228 осуществляли непрерывным способом в две стадии, в условиях перемешивания и аэрации, при различных значениях рН и температуры на различных стадиях по примеру 3. На 2-й стадии ферментации в аппарат подавали додециламмоний ацетат в концентрации 50 мг/л. Длительность ферментации 5 суток. Концентрация лимонной кислоты в среде 45 г/л, производство лимонной кислоты 324,0 г/сутки или 13,5 г/ч.

Пример 7. Гриб А.niger ВСБ-228 культивировали в непрерывном (одностадийном) режиме на мелассной питательной среде после сорбционной очистки. Подготовку мелассы к ферментации осуществляли по примеру 3.

Режим ферментации: культивирование гриба осуществляли непрерывным способом при одностадийной ферментации в аппарате с рабочим объемом 10 л, при первоначальной t 33^oС и рН 6,8. Скорость перемешивания и степень аэрации среды по примеру 3. После формирования мицелиальной массы, снижения скорости роста t среды снизили до 31^oС, и процесс перевели на непрерывный режим путем подачи в ферментер свежей мелассной среды с содержанием РВ 6% Мелассную питательную среду подавали со скоростью разбавления среды Д 0,03 час^-1. В ферментер подавали также 10 мг/л додецилсульфата натрия. Длительность ферментации 5 суток. Концентрация лимонной кислоты в среде 25 г/л, производство лимонной кислоты 180 г/сутки или 7 г/ч.

Таким образом, при производстве лимонной кислоты непрерывным 2-х стадийным способом, но без снижения рН на первой стадии и без подачи пермеабилизирующих реагентов на вторую стадию ферментации, концентрации лимонной кислоты в среде на 40 50% ниже чем в предлагаемом способе (примеры 3 6).

Использование: изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способу получения лимонной кислоты при культивировании гриба Aspergillus niger, и может быть использовано в пищевой промышленности, медицине, фармакологии. Сущность изобретения состоит в том, что подготовку меллассы к ферментации осуществляют путем сорбционной очистки на клиноптилолите, причем через 24 - 36 ч от начала культивирования рН среды снижают до 2,5 - 3,0 путем подачи в среду кислых титрантов, а на второй стадии осуществляют индуцированную экскрецию лимонной кислоты путем подачи в среду пермеабилизирующих реагентов при концентрациях 0,001 - 0,01%. 1 з.п. ф-лы, 3 табл., 1 ил.

1. Способ получения лимонной кислоты в непрерывном режиме, включающий культивирование грибка Aspergillus niger в условиях аэрации и перемешивания среды при поддержании на первой стадии рН на уровне 2,5 3, выделение лимонной кислоты, отличающийся тем, что на первой стадии через 24 36 ч от начала культивирования рН среды снижают до 2,5 3 за счет введения в среду кислых титрантов, а на второй стадии культуральную среду обрабатывают пермеабилизирующими реагентами при концентрациях 0,001 0,01%
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве пермеабилизирующих реагентов используют поверхностно-активные вещества додецилсульфат натрия, твин 40, твин 80 и додециламмоний ацетат.