ШТАММ ГРИБА ASPERGILLUS NIGER - ПРОДУЦЕНТ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 1997 года по МПК C12N1/14 C12P7/48 C12N1/14 C12R1/685 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к производству лимонной кислоты глубинным методом при периодической или непрерывной ферментации штамма-продуцента.

Известен штамм Aspergillus niger P-1, продуцент лимонной кислоты, селекционированный путем ступенчатого воздействия УФ лучами и химическими мутагенами (авт. св. СССР, N 568677, кл. C 12 K 1/02 1975).

Недостатком известного штамма является низкие показатели биохимической активности.

Известен также штамм A.niger R-3, продуцент лимонной кислоты, полученный в результате селекции путем ступенчатой обработки этиленимином, N нитрозометилмочевиной и УФ лучами штамма A.niger ЭУ-119 (авт. св. СССР N 939549 C 12 P 7/48).

Недостатком известного штамма является то, что он проявляет активность только на средах с низкой первоначальной концентрацией сахара, не более 3% и не адаптирован к высоким первоначальным концентрациям сахара в среде.

Кроме того, штамм A.niger R-3 предназначен только для производства лимонной кислоты периодическим способом.

Задача изобретения заключается в увеличении выхода лимонной кислоты.

Технический результат изобретения получение нового штамма Aspergillus niger F-718 с более высокой активностью кислотообразования.

Штамм A.niger F-718 получен в результате селекции путем ступенчатой обработки N-нитрозометилмочевиной и нитрозонитрометилмочевиной штамма A.niger F-710.

Штамм хранится в коллекции микроорганизмов ГосНИИ-синтезбелок N945/1.

Штамм также депонирован в Музее культур промышленных микроорганизмов института ГНИИгенетика и имеет коллекционный номер ВКПМ F-718.

Культурально-морфологическая характеристика штамма А.nider F-718.

В условиях поверхностного культивирования на суслоагаровой среде у пятисуточной культуры конидиальные головки округлые, в диаметре 200-250 мкм. Стеригмы однослойные, длиной 10-17 мкм. Конидии светло-коричневые, округлые, в диаметре 6-8 мкм. Конидиеносцы длиной 1-4 мм.

Гигантская пятисуточная колония A.niger F-718, выращенная на сусло-агаровой среде, имеет округлую форму, диаметр колонии 45-48 мм, аспорогенная зона 5-10 мм. Центр колонии выпуклый со светло-коричневым спороношением. Край колонии ровный.

Физиолого-биохимическая характеристика
Штамм A.niger F-718 хорошо сбраживает мелассу. Выход лимонной кислоты от сахара мелассы до 100% Из суммы синтезируемых органических кислот доля лимонной кислоты составляет 92-99%
Благодаря высокой амилолитической активности штамм хорошо развивается на крахмалсодержащих средах, а также ассимилирует сахарозу, глюкозу, мальтозу, гидролизаты растительного сырья, этанол. Усваивает органический и минеральный азот.

Посевной материал штамма A.niger F-718, в зависимости от условий производства, готовят двумя способами:
1. Посев спорами.

Готовят споруляционную среду, содержащую источник углерода, азота и минеральные соли. В качестве источника углерода используют пивное сусло или солодовый экстракт. В среду добавляют следующие компоненты,
Мочевина 0,1
NaCl 1 1,5
CuSO₄•5H₂O 0,0001
Агар 2 2,5
pH устанавливают на уровне 4 6,5
Среду засевают спорами с помощью ватного тампона или пульверизатора. Культивирование поверхностным способом производят в режиме регулирования температуры и влажности в течение 7-10 сут.

При культивировании указанным способом с 1 дм² споруляционной площади получают 1,4-1,5 г спор. Содержание спор в 1 г до 48 млрд. Всхожесть спор в мелассном растворе через 8-10 ч 95-99%
2. Посев проросшим мицелием гриба.

Готовят стерильную мелассную питательную среду с содержанием 2% PB, сахарозы (сахара) 0,5%этилового спирта 0,1% KH₂PO₄ 0,02% MgSO₄ 0,02% ZnSO₄ 10 мг/л, CoSO₄ 0,1 мг/л, Na₂MoO₄ 0,5 мг/л.

Устанавливают pH среды в пределах 4,0-5,0. Среду разливают в качалочные колбы и засевают смывом мицелия гриба A.niger. Мицелий подращивают при температуре 32-35^oC в течение 16-24 ч, затем, в количестве 5-15 мл. переводят в колбы, содержащие стерильную 3-4%-ную мелассную среду с минеральными компонентами. PH среды 4-5. Культивирование осуществляют при температуре 32-35^oC в течение 24 ч.

Подрощенный мицелий служит посевным материалом при ферментации в маленьких ферментерах или используется для получения посевного материала в посевном ферментаторе. Полученный указанным способом посевной материал может быть использован в производстве лимонной кислоты при глубинном способе ферментации в периодическом или непрерывном режиме.

Исследование продуктивности штамма F-718 на мелассной питательной среде показало, что штамм обладает высоким уровнем продуктивности, выход лимонной кислоты от сахара составляет 95-97%в то время как выход от сахара при использовании штамма F-710 составляет 88-90%
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.

ПРИМЕР 1 (контрольный). В качестве продуцента лимонной кислоты использовали штамм Aspergillus niger F-710.

Стерильную мелассную среду с содержанием PB 2% сахарозы 0,5% этилового спирта 0,1% а также солей магния, цинка, кобальта и молибдена засеяли мицелием гриба A. niger F-710. Исходная величина pH среды 5,0. Мицелий гриба подращивали при температуре 32^oC в течение 20 ч, затем 15 мл суспензии перенесли в качалочные колбы, содержащие 150 стерильной мелассной среды с содержанием PB 3% и культивировании при температуре 32^oC в течение 24 ч. Подрощенный мицелий использовали в качестве посевного материала для ферментации.

Ферментацию проводили периодическим способом на мелассной питательной среде с величиной pH 5,5 и с первоначальным содержанием PB в среде 3% В процессе ферментации концентрацию PB в среде постепенно увеличили до 10% Продолжительность ферментации 6 сут. Выход лимонной кислоты от PB 88%
ПРИМЕР 2. В качестве продуцента лимонной кислоты использовали штамм A. niger F-718. Посевной материал для ферментации получали в колбах на качалке на мелассной питательной среде, содержащей сахарозу, этиловый спирт и источники магния, цинка, кобальта и молибдена по примеру 1.

Ферментацию также проводили периодическим способом на мелассной питательной среде с первоначальным содержанием PB 3% и с исходной величиной pH 5,5. Концентрацию PB в процессе ферментации увеличили до 10% путем доливок концентрированной мелассы (PB 20-25%). Продолжительность ферментации 6 сут.

Концентрация лимонной кислоты в культуральной жидкости составляла 78 г/л, выход от PB 97,5%
В таблице представлены сравнительные данные по биосинтезу лимонной кислоты известным и предлагаемым штаммами в зависимости от первоначальной величины pH среды при периодическом способе ферментации.

Результаты, представленные в таблице показывают, что снижение исходной величины pH среды от 7,0 до 3,0 не оказывает существенного значения на биосинтез лимонной кислоты штаммом гриба A.niger F-71, тогда как активность биосинтеза лимонной кислоты штаммом A.niger F-710 снижается на 10-18% Адаптация штамма продуцента к более кислым первоначальным значениям pH (в пределах от 5,5 до 3,0) имеет огромное промышленное значение, так как при этом значительно снижается риск возникновения посторонней микрофлоры в среде. Кроме того, при быстром закислении среды гриб преимущественно синтезирует лимонную кислоту, а синтез побочных кислот (щавелевой и глюконовой) снижается до минимальных значений.

ПРИМЕР 3. Посевной материал для ферментации получали по примеру 2 с использованием в качестве продуцента лимонной кислоты A.niger F-718.

Ферментацию продуцента осуществляли в непрерывном режиме на мелассной питательной среде в две стадии.

Культивирование на первой стадии осуществляли при первоначальной величине pH Среды 5.0 и температуре 33^oC. Через 48 ч от начала ферментации, после снижения интенсивности образования биомассы мицелия, процесс перевели на непрерывный режим путем непрерывной подачи в ферментационную среду мелассного питательного раствора с содержанием редуцирующих веществ 8% со скоростью разбавления Среды 0,025 ч 1. Культуральная жидкость с первого ферментера с такой же скоростью разбавления Среды поступала на вторую стадию (во второй ферментер), где ферментацию осуществляли при температуре 31^oC.

pH на второй стадии поддерживали в пределах 2,0-2,5.

Культуральная жидкость после отделения биомассы гриба использовалась для выделения лимонной кислоты. Концентрация лимонной кислоты в культуральной жидкости составляла 77 г/л, выход от PB 96%
Таким образом, использование штамма гриба A.niger F-718 в качестве продуцента лимонной кислоты дает возможность проведения ферментации при более кислых первоначальных значениях pH Среды, что существенно снижает риск возникновения инфекции в Среде, выход лимонной кислоты при этом возрастает в среднем на 10%
Кроме того, штамм A.niger F-718 адаптирован к ферментации в непрерывном режиме.

Использование: в биотехнологии, производство лимонной кислоты периодическим или непрерывным способом. Сущность изобретения: новый штамм гриба Aspergillus niger ВКПМ F-718 продуцент лимонной кислоты. Технический результат изобретения заключается в получении нового штамма A. niger - продуцента лимонной кислоты с высокой активностью кислотообразования. Использование нового штамма в производстве лимонной кислоты позволяет вести процесс при более низких значениях pH среды, что существенно снижает риск возникновения инфекции в среде, при этом выход лимонной кислоты возрастает в среднем на 10%. Кроме того, штамм адаптирован к ферментации в непрерывном режиме. 1 табл.

Штамм гриба Aspergillus niger ВКПМ F-718 продуцент лимонной кислоты.