КОМПЛЕКС 1-ЭТИЛИМИДАЗОЛА С АСКОРБАТОМ ЦИНКА, ПОВЫШАЮЩИЙ УСТОЙЧИВОСТЬ ОРГАНИЗМА К ДЕЙСТВИЮ ДИОКСИДА АЗОТА И ОБЛАДАЮЩИЙ ЦИТОПРОТЕКТОРНЫМ И АНТИГИПОКСИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ Российский патент 1994 года по МПК C07D307/62 C07D233/04 A61K31/375 A61K31/415 

Изобретение относится к новому химическому соединению - комплексу 1-этилимидазола с аскорбатом цинка (асказолу) формулы
повышающему устойчивость организма к действию диоксида азота и обладающему цитопротекторной и антигипоксантной активностью (N государственной регистрации 10191991).

Известно, что для защиты организма от поражений диоксидом азота использовались суспензии сульфидина, пирамидона и их сочетания, анальгин и другие производные пиразолина, дитиопропанол, аскорбиновая кислота и ее комбинации с сульфидином (Абрамов Ж.И. Сб. "Рефераты научных работ токсикологической лаборатории", информ. бюллетень ГосНИИ гигиены труда и профзаболеваний, Л., 1950 г. ), глутаминовая кислота (Коперский Ф.К. Автореферат дисс.канд. биологич. наук, Кишинев, 1983 г.). Однако, эти препараты не дают стойкого (до 24 ч) эффекта и должны вводиться в высоких дозах (до 1000 мг/кг). Это в пересчете на организм человека составляет недопустимо большие количества препарата, затрудняющие его использование у пораженных диоксидом азота. Защитным эффектом при воздействии диоксида азота обладает и преднизолон (Dillerw F. BGA Schritten, 1986, N 4, Р.301), который при однократном брюшинном введении в дозе 8,5 мг/кг снижает смертность белых мышей при отравлении этим ядом на 15%.

Наиболее близким по свойствам к заявляемому асказолу является крецизол (Воронков М.Г., Скушникова А.И., Домнина Е.С. и др. Пол. решение по заявке N 47336887/04 от 22.11.90 г. ), который при однократном внутрибрюшинном введении в дозе 5 мг/кг обладает защитной эффективностью к острому воздействию диоксида азота, снижая на 45% количество подопытных животных, погибших от токсического отека легких. Однако биологическое действие крецизола является ограниченным. В частности, повышая устойчивость к острому токсическому действию NO₂, крецизол не защищает макрофагальные клетки от цитотоксических повреждений и не повышает резистентность к развивающемуся при интоксикации гипоксическому состоянию организма, что требует дополнительного применения лекарственных средств при лечении острого отравления и в восстановительном периоде.

Целью изобретения является поиск препаратов, обладающих широким спектром защитного действия при остром ингаляционном отравлении диоксидом азота среди комплексных соединений азольного ряда.

Поставленная цель достигнута синтезом асказола - комплекса I - этилимидазола с аскорбатом цинка. Заявляемый препарат в дозе 5 мг/кг при однократном введении оказал достоверный защитный эффект, повышая выживаемость подопытных животных до 60% (через 2 часа) после острого воздействия NO₂ при 100% гибели в контроле. Асказол в широком диапазоне концентраций от 10^-7 до 10^-3 М обладал выраженной цитопротекторной активностью, защищая макрофаги от повреждающего действия цитотоксического агента. Кроме того, он повышал устойчивость экспериментальных животных к острой гипоксической гипоксии, обеспечивая выживаемость на уровне 65% при 25% в контроле.

Таким образом, по сравнению с прототипом крецизолом, заявляемый препарат асказол может быть использован для защиты организма от поражений диоксидом азота с одновременным проявлением цитопротекторной и антигипоксантной активности. Способ получения асказола прост, одностадиен и заключается во взаимодействии 1-этилимидазола с аскорбатом цинка в воде при комнатной температуре. Выход препарата достигает 65% . Асказол представляет собой порошок желтого цвета, растворимый в воде, ДМСО. Состав и строение его подтверждены данными элементного анализа и ИК-спектроскопии. Следующие примеры иллюстрируют изобретение.

П р и м е р 1. Синтез аскорбата цинка.

К суспензии 4,0 г гидроокиси цинка Zn(OH)₂ в 40 мл воды, нагретой до 60^оС, прибавляют раствор 7,4 г аскорбиновой кислоты в 30 мл воды. Реакционную смесь перемешивают на магнитной мешалке в течение 6 ч при 50^оС. Во время реакции наблюдается постепенное растворение суспензии. Непрореагировавший осадок Zn(OH)₂ отфильтровывают. Из фильтрата удаляют в вакууме основную массу воды, соль выделяют смесью ацетон:эфир = 1:1, промывают серным эфиром и сушат в вакууме. Получают 8,6 г (75,3 мас.%) аскорбата цинка в виде тонкодисперсного порошка желтого или желто-оранжевого цвета, растворимого в воде. Соль содержит, мас.%: C 29,33; H 3,76; Zn 26,16; O 40,75 по разности.

Вычислено, мас.%: C 30,08; H 2,51; Zn 27,31; O 40,10.

Т.пл. 104^оС.

В ИК-спектре аскорбата цинка содержится полоса в области 1600-1610 см^-1 - С=С-группа ендиольной группировки, 1710 см^-1 - С=О-группа, 2800-3000 см^-1 - СН₂, СН-группы, 3300-3400 см^-1 - ОН-группы.

Данные ТСХ нельзя использовать для идентификации этого соединения, поскольку оно в различных растворителях не дает индивидуального пятна (остается на старте).

П р и м е р 2. Синтез асказола (комплекса 1-этилимидазола с аскорбатом цинка).

К суспензии 0,4 г аскорбата цинка в 50 мл ацетона, нагретой до 35-40^оС, приливают 0,32 г (0,3 мл) 1-этилимидазола. Реакционную смесь перемешивают в течение 30 мин. После удаления из нее основной массы ацетона безводным серным эфиром выделяют 1-этилимидазол с аскорбатом цинка (асказол) в виде порошка желтого цвета, растворимого в воде, ДМСО. Выход комплекса 65% (0,467 г), Т. пл. 65^оС. Состав комплекса L:A = 2:1 (L-1-этилимидазол, А - аскорбат цинка).

Вычислено, мас.%: C 44,51; H 5,1; N 12,98; O 22,25; Zn 15,16.

С₁₆Н₂₂N₄O₆Zn.

Найдено, мас,%: C 43,5; H 4,94; N 12,36; Zn 15,25; O 23,95, по разности.

В ИК-спектре комплекса содержатся полосы деформационных и внеплоскостных колебаний имидазольного кольца при 670 см^-1 и в области 800-1100 см^-1, полоса СН₃-группы 1-этилимидазола при 1380 см^-1. Полосы С=С-группы при 1600 см^-1, полосы С=О-группы при 1777, 1729 см^-1, ОН-группы при 3300-3400 см^-1, полосы СН₂, СН-групп в области 2800-3000 см^-1 подтверждают вхождение аскорбата цинка в состав комплекса.

П р и м е р 3. Влияние асказола на устойчивость организма к действию диоксида азота.

Токсичность и сравнительная эффективность препаратов асказола и крецизола (прототип) исследованы в параллельных опытах на белых мышах - самцах массой тела 18-22 г. Препараты вводили внутрибрюшинно в виде водных растворов в объеме 0,1 мл на 10 г массы животного. Контрольным животным вводили физиологический раствор. Внутрибрюшинный путь введения является общепринятым в экспериментальных токсиколого-фармакологических исследованиях, так как позволяет в короткие сроки осуществить введение лекарств представительной группе особей и обеспечивает быстрое всасывание введенных веществ и поступление их в кровоток, приближаясь к условиям внутривенных инъекций.

Токсичность исследуемых препаратов оценивали по значениям ЛD₅₀, который рассчитывали по методу Беренса при 2-недельном наблюдении за животными после введения препаратов. Стандартную ошибку ЛD₅₀ определяли с использованием формулы Гэддама.

Для обоснования выбора эффективной дозы асказола проводили исследование защитных свойств препарата при 60-минутных динамических затравках белых мышей диоксидом азота в концентрации 300 мг/м³. Асказол вводили подопытным мышам в дозах 1,0-25,0 мг/кг за 30 мин до затравки. Критерием защитного действия служили показатели выживаемости экспериментальных животных. Введение асказола позволило повысить выживаемость подопытных животных по сравнению с контролем. Среднюю эффективную дозу (ЕД₅₀) асказола, как и крецизола, рассчитывали по методу Литчфилда-Вилкоксона. Значения ЛD₅₀ и ЕД₅₀, представленные в табл.1, свидетельствуют об отсутствии достоверных различий по данным показателям между исследуемыми препаратами. Это обстоятельство явилось основанием для проведения сравнительных исследований асказола и крецизола в дозе, близкой к ЕД₅₀ (5,0 мг/кг).

Сравнительные исследования защитной эффективности асказола и крецизола проводились при 60-минутных динамических затравках белых мышей диоксидом азота в концентрации 800 мг/м³. Такие воздействия приводили к 100%-ной гибели контрольных животных в течение 2 ч. после окончания затравки. При этом, в случае применения асказола летальность составляла 40%, а при использовании крецизола 85% (табл.2). Значения коэффициента Калушнера, характеризующего динамику гибели животных после затравки при 6-часовом периоде наблюдения, также были на 21% (Р < 0,05) выше в группе животных, получавших асказол, по сравнению с крецизолом (табл.2).

Результаты параллельных опытов свидетельствуют, что при сопоставимых значениях токсичности и ЕД₅₀, асказол в дозе 5,0 мг/кг оказывает более выраженное защитное действие по отношению к диоксиду азота, чем препарат крецизол.

П р и м е р 4. Цитопротекторная активность комплекса 1-этилимидазола с аскорбатом цинка.

Сравнительные исследования цитопротекторных свойств асказола и крецизола проводили в параллельных опытах на модели повреждения культуры макрофагов пылью диоксида кремния (ДК). Популяцию перитонеальных макрофагов, полученную от беспородных белых крыс после однократной стимуляции внутрибрюшинным введением стерильного вазелинового масла, инкубировали с взвесью пыли кварца DQ12 (ФРГ) в трис-HCl-буфере, содержащем 0,15 М КCl (рН 7,4), в течение 1,5 ч при 37^оС .1 мл инкубационной среды содержал 3^.10⁶ клеток и 1 мг ДК. В пробы опытных серий помимо макрофагов и ДК вводили растворы асказола и крецизола в концентрациях от 10^-7 до 10^-3 М. Параллельно в каждой серии опытов были пробы, инкубированные без ДК. Жизнеспособность клеточной популяции после окончания инкубации определяли с помощью прижизненной окраски Трипановым синим и выражали процентом жизнеспособных, т.е. не окрашиваемых клеток. Статистическую значимость различий оценивали по критерию t-Стьюдента. Результаты параллельных опытов, представленные в табл.3, свидетельствуют, что асказол в концентрации 10^-5 М оказывал выраженное цитозащитное действие, снижая повреждающий эффект диоксида кремния. Уровень погибших клеток при этом был на 34% (Р < 0,05) ниже, чем в контроле. Этот эффект асказола сохранялся и при его концентрации 10^-6 М. В то же время крецизол не оказывал достоверного защитного действия во всем диапазоне концентраций, а в концентрациях 10^-5 и 10^-6 М проявлялась тенденция к собственной цитотоксичности.

Таким образом, асказол, в отличие от крецизола, проявлял цитопротекторную активность, снижая в концентрациях 10^-6-10^-5 М повреждающий эффект ДК на культуру макрофагов.

П р и м е р 5. Антигипоксантная активность комплекса 1-этилимидазола с аскорбатом цинка.

Сравнительные исследования антигипоксантных свойств асказола и крецизола проводили в параллельных опытах на белых мышах массой тела 18-22 г. Гипобарическую гипоксию вызывали путем "подъема" мышей в барокамере со скоростью 30 м/с с последующей 10-минутной экспозицией на высоте 9000 м. Степень антигипоксантной активности препаратов оценивали по критерию выживаемости животных. Асказол и крецизол вводили белым мышам внутрибрюшинно в дозе 5,0 мг/кг за 30 мин до начала гипоксического воздействия. Достоверность отличий оценивали с помощью точного метода Фишера для четырехпольной таблицы.

Результаты параллельных опытов, представленные в табл.4, свидетельствуют, что асказол в дозе 5,0 мг/кг оказал антигипоксантное действие, достоверно (P < 0,05), повышая выживаемость белых мышей при моделировании гипоксической гипоксии как в сравнении с контролем, так и в сравнении с крецизолом. Использование крецизола в дозе 5,0 мг/кг не приводило к достоверному проявлению активности при гипоксической гипоксии в условиях опыта.

Таким образом, асказол, в отличие от прототипа крецизола при применении в дозе 5 мг/кг обладал выраженной антигипоксантной активностью, на 44% повышая выживаемость белых мышей при острой гипоксической гипоксии.

В азолах и азольных амбидентных системах с N,N-донорными центрами соли металлов (MX_n) и лиганд координировали по нуклеофильному N₃-атому, который несет самый высокий π-электронный заряд, имеет близкую к sp²-гибридизацию и максимальную степень локализации координационной пары [1-3].

Для доказательства строения комплексов 1-этил- и 1-винилазолов, места координации связи привлечены методы ИК-, УФ-, ПМP-спектроскопии, которые позволяют судить о природе химической связи металл-лиганд, об электронном строении лигандов, решать определенные задачи структурной химии.

Комплексообразование 1-этилимидазола и 1-винилимидазола (ВИМ) с хлоридами переходных металлов и солями цинка приводит к смещению полос валентных колебаний гетерокольца (связи C=N) при 1495, 1510 см^-1 в коротковолновую область на 10-20 см^-1 и деформационных (818 см^-1) на 15-25 см^-1. Так, например, для заявляемого комплекса 1-этилимидазола (ЭИМ) с аскорбатом цинка полоса валентных колебаний C= N гетерокольца смещается в коротковолновую область и проявляется при 1520 см^-1. Полоса деформационных колебаний гетерокольца при 818 см^-1 смещается до 833 см^-1.

Смещение валентных колебаний гетерокольца к высоким частотам при одновременном изменении интенсивности полос деформационных колебаний свидетельствуют об участии неподеленной пары электронов N₃-атома в донорно-акцепторном взаимодействии. Все исследованные комплексы 1-этил- и 1-винилимидазолов представляют собой мономерные молекулярные соединения донорно-акцепторного типа.

Для установления места локализации координативной связи в донорно-акцепторных соединениях 1-винил- и 1-этилимидазола с солями металлов использовали метод ПМР спектроскопии с применением парамагнитных добавок (например, комплекса 4-ВИМ.NiCl₂, 4ЭИМ.NiCl₂) [4,5].

Исследуя зависимость уширения резонансных линий (Δ) протонов кольца от t^о в спектрах 1-этил- и 1-винилимидазола однозначно установлено, что комплексообразование данных лигандов идет по N₃ атому с реализацией N-металл-взаимодействия по σ-типу.

Для заявляемого асказола не удалось получить монокристаллы (он представляет собой порошок желтого цвета) и установить его пространственное строение с помощью рентгеноструктурного анализа. Однако нами установлено пространственное строение комплексов ионов Cu⁺² и Со⁺²с 1-винилимидазолом, имеющим те же центры координации [6]. Рентгеноструктурные исследования комплексов (C₅H₆N₂)₄^.CuCl₂ и (C₅H₆N₂)₄^.CoCl₂ показали, что структура
комплексов ВИМ с CuCl₂ имеет вид прямоугольной тетрагональной бипирамиды. Координационный полиэдр атома металла образован двумя атомами хлора, занимающими аксиальные позиции и четырьмя атомами азота имидазольных колец, лежащими в экваториальной плоскости. Аналогичный тетраэдр в структуре комплекса ВИМ с CoCl₂искажен. Ориентировка плоскостей винильных групп близка к ориентировке плоскостей имидазольных колец.

Таким образом, пространственное строение комплексов 1-винил-имидазола так же как и данные исследования их ИК- и ПМР-спектров подтверждают монодентатный характер 1-винилимидазола, который координирует металлы по атому азота в третьем положении.

Использование: в медицине, в частности в средствах, повышающих устойчивость организма к действию диоксида азота и обеспечивающих цитопротекторное и антигипоксическое действие. Сущность изобретения: продукт - комплекс 1-этилимидазола с аскорбатом цинка, БФ C₁₆H₂₂N₄O₆Zn, т.пл. 65°С, выход 65%. Реагент 1: 1-этилимидазол. Реагент 2: аскорбат цинка. Условия реакции: в водной среде при комнатной температуре. 4 табл.

Комплекс 1-этилимидазола с аскорбатом цинка формулы

повышающий устойчивость организма к действию диоксида азота и обладающий цитопротекторным и антигипоксическим действием.