СПОСОБ ОТТАИВАНИЯ ЗАМОРОЖЕННЫХ В ГРАНУЛАХ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Российский патент 1997 года по МПК A61D19/02 

Изобретение относится к животноводству и ветеринарии, в частности, к способам и инструментам для размножения животных методом искусственного осеменения.

Известен способ оттаивания биологических объектов, например семени животных, путем помещения емкости с семенем в водяную баню температурой 0-95^oC с последующей стабилизацией до физиологически нормальной температуры (Ф.И. Осташенко. Глубокое замораживание и длительное хранение спермы производителей. Киев, 1968, с.90-97).

Недостатком известного способа является повреждение клеток в процессе оттаивания, так как ввиду медленного режима размораживания на клетку воздействуют сопутствующие реклисталлизации неблагоприятные факторы.

Известен способ оттаивания биологических объектов, например семени животных, путем помещения капилляра с семенем в нагретую воду с последующей стабилизацией температуры до физиологически нормальной. При этом капилляр с семенем помещают в глицерин, нагретый до 150-200^oC и выдерживают в нем в течение 2 4 с (авт. св. N 552967, кл.A 61 D 19/02, 1977). Способ позволяет повысить сохранность клеток в процессе размораживания. Однако его применение связано с применением дорогого препарата глицерина, что значительно усложняет технологию оттаивания семени животных.

Известен способ оттаивания биологических объектов, например семени животных, замороженного в облицованных гранулах. Обойму с тубами поднимают в сосуде Дьюара или другом биохранилище стержнем держателем на уровень жидкого азота, открывают пробки и из каждого контейнера отбирают пинцетом с плоскими браншами по одной грануле, которые переносят в подогретую до 40^oC воду на 8-10 с. Поверхность пленочной оболочки гранулы с оттаянным семенем вытирают стерильной салфеткой, вскрывают ножницами и определяют подвижность сперматозоидов под микроскопом. При герметизации доз семени в оптически прозрачную трубку дозу не вскрывают, а оценивают семя под микроскопом через прозрачную стенку (Инструкция по организации и технологии работы станций и предприятий по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных. М. Колос, 1981, с.63-64).

Известен способ оттаивания концентрированных гранул объемом 0,1-0,2 мл. Одну гранулу (дозу) помещают в стеклянный флакон с 1 мл 2,9%-ного раствора лимоннокислого натрия (цитрата натрия), предварительно подогревают до 40-42^oC. Флакон, не доставая из воды, осторожно покачивают до растаивания гранулы, после чего сразу вынимают из воды и оценивают по общепринятой методике (Инструкция по организации и технологии работы станций и предприятий по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных. М. Колос, 1981, с.64).

Известна группа устройств для размораживания биологических объектов, например, для оттаивания биологических сред, используемых при искусственном осеменении сельскохозяйственных животных; устройство содержит кожух, размещенный в нем теплопроводный корпус с ячейками для емкостей с биологической средой и нагреватель, соединенный с источником электропитания, причем корпус имеет полость с веществом, температура которого равна температуре размораживания, и мембрану для взаимодействия с контактным элементом (авт. св. N 1535539, кл. A 61 D 19/02, 1990);
устройство для оттаивания семени животных, включающее алюминиевый блок и нагревательный элемент, причем блок выполнен в виде цилиндра со сквозным отверстием, внутри которого размещен сердечник, а снаружи выполнены отверстия-гнезда для размещения нагревателя и регулятора температуры (авт. св. N 1540816, кл. A 61 D 19/02, 1990); а также
устройство для оттаивания семени животных, состоящее из емкости для хладагента, нагревателя, выполненного в виде термоса с теплоносителем, источника давления, соединенного с помощью термоса (авт. св. N 1739987, кл. A 61 D 19/02, 1990).

Упомянутые устройства повышают эффективность отдельных операций в технологии оттаивания семени животных, однако они отличаются значительной сложностью конструктивных решений.

Известна другая группа устройств для оттаивания семени животных, замороженного в гранулах, более простых по конструкции, с более узким кругом выполняемых функций:
флакон из-под пенициллина (Инструкция по организации и технологии работы станций и предприятий по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных. М. Колос, 1981, c.64);
ампула для хранения разбавителей семени и размораживания в ней гранул семени животных; ампула имеет цилиндрическую емкость, переходящую в шейку с перехватом и капилляром, причем в месте перехода в шейку ампула имеет конусообразное расширение (авт. св. N 1546082, кл. A 61 D 19/02, 1990);
сосуд для оттаивания семени, выполненный в виде трубки с расширением на одном конце и пробкой на другом, причем середина трубки выполнена с расширением в одной плоскости и сужением в перпендикулярной ей плоскости (авт. св. N 1565483, кл. A 61 D 19/02, 1990).

Известно устройство для оттаивания замороженных в гранулах биологических объектов, например, семени быков-производителей, взятое в качестве прототипа. Такое устройство стеклянная ампула, емкостью 2 и 3 мл, предназначенная для герметической расфасовки 1 мл 2,9%-ного раствора цитрата натрия, нейтрализованного ТУ 10.07.049-88, -выпускается промышленным способом. Ампула состоит из корпуса, донышка и конусообразного запаянного наконечника (ОСТ 64-2-485-85).

Упомянутые способы и устройства способствуют ускорению оттаивания и повышению качества оттаянного семени животных. Однако они недостаточно технологичны, их применение обходится сравнительно дорого, что повышает стоимость спермодозы.

В России имеются значительные запасы семени, полученного от ценных в племенном отношении быков-производителей и замороженного в гранулах. Использование способов и устройств, основанных на применении лимоннокислого натрия, связано с импортом из других стран этого препарата.

При создании настоящего изобретения задача заключалась в разработке способа и устройства, повышающих эффективность оттаивания замороженного в гранулах семени быков-производителей и других биологических объектов, исключающих применение дефицитного лимоннокислого натрия, а также стеклянных флаконов и ампул.

Технический результат изобретения достигается тем, что предложен способ оттаивания семени быков-производителей, замороженного в гранулах, включающий извлечение гранулы из хладагента, перенесение ее в емкость для помещения в теплоноситель, помещение емкости с гранулой в теплоноситель и оттаивание, особенностью которого является то, что после извлечения гранулы из хладагента ее переносят в сухую пробирку из водонепроницаемого эластичного материала, обжимают пинцетом или другим устройством стенки пробирки над гранулой и помещают в теплоноситель-жидкость, например воду, подогретую до 34-45^oC на 10 25 с.

В устройстве для оттаивания замороженных в гранулах биологических объектов, например семени быков-производителей, включающем емкость для размещения извлеченной из хладагента гранулы и помещения ее вместе с гранулой в теплоноситель, особенностью является то, что емкость выполнена из эластичного водонепроницаемого материала, например полиэтиленовой пленки, в виде пробирки с толщиной стенок от 10 до 40 микрон, высотой от 2 до 5 раз превышающей диаметр гранулы, причем отверстие пробирки окантовано утолщенным ободком, высота которого составляет 1/4 1/7 общей высоты пробирки, а толщина от 0,5 до 1,5 мм.

Опыт 1. Семя от 6 быков-производителей после замораживания в гранулах на сухом льду оттаивали по две гранулы в термостате при 38^oC. Одну гранулу семени каждого быка оттаивали в стеклянной ампуле с 2,9%-ным раствором лимоннокислого натрия, вторую гранулу в полимерных пробирках без раствора лимоннокислого натрия. Причем при оценке для обеспечения сопоставимых условий к оттаянному в полимерных пробирках семени (без раствора) приливали количество раствора лимоннокислого натрия, равное использованному в известном способе (1 мл). Биологическую полноценность оттаянного семени in vitro оценивали по ГОСТ 26030 83 "Сперма быков замороженная. Технические условия".

Результаты опыта представлены в табл.1.

Как видно из представленных в табл.1 данных, по биологическим показателям in vitro семя быков-производителей, оттаянное в полимерных пробирках без раствора лимоннокислого натрия, практически не отличалось от семени, оттаянного в растворе лимоннокислого натрия.

Согласно упомянутому ГОСТу подвижность семени должна составлять: после оттаивания не менее 4 баллов; через 5 ч семя должно оставаться живым; показатель абсолютной живучести должен быть не менее 12. В опыте 1 подвижность семени составляла после оттаивания известным способом 4,8 ± 0,17 балла, новым способом 5,5 ± 0,18 балла, через 5 часов соответственно: 3,0 ± 0,5 и 3,5 ± 0,45 балла; показатель абсолютной живучести - соответственно: 26,2 ± 2,9 и 31,0 ± 2,7.

Опыт 2. В совхозе "Ямской" Домодедовского района Московской области в 1994 г. изучали влияние на результативность осеменения коров оттаивания семени быков-производителей с лимоннокислым натрием и без него. В эксперименте использовали семя одного эякулята быка-производителя.

Результаты опыта представлены в табл.2.

Как видно из данных, представленных в табл.2, результативность осеменения коров семенем, оттаянным без лимоннокислого натрия в полимерных пробирках, практически не отличалась от результативности осеменения коров семенем быков-производителей, оттаянным с лимоннокислым натрием в стеклянных ампулах.

На фиг. 1 и 2 схематично изображена пробирка для оттаивания замороженных в гранулах биологических объектов, например семени быков-производителей. Пробирка состоит из стенки 1, донышка 2, отверстия 3 и ободка 4. Пробирка может быть выполнена цилиндрической (фиг. 1), конусообразной (фиг. 2) или другой формы. Толщина стенки 1 пробирки составляет от 10 до 40 микрон. Высота пробирки от 2 до 5 раз превышает диаметр гранулы и составляет, в частности 35 мм, диаметр отверстия 3 пробирки в 1,5 3 раза превышает диаметр гранулы и составляет, в частности, 13 мм. Отверстие 3 пробирки окантовано утолщенным ободком 4, высота которого составляет 1/4 1/7 общей высоты пробирки, а толщина ободка от 0,5 до 1,5 мм.

Каждая пробирка герметично упакована полиэтиленовой пленкой обычным способом.

Устройство работает следующим образом.

Пакеты, в которых запечатаны пробирки, после упаковки стерилизуют с помощью гамма-установки или другими способами.

Надрезают уголок пакета стерильными ножницами и извлекают из него стерильную полимерную тонкостенную пробирку, отверстие 3 которой окантовано утолщенным ободком 4. Из сосуда Дьюара пинцетом извлекают гранулу замороженного семени быка-производителя и переносят ее в пробирку. Стенки 1 пробирки пережимают пинцетом таким образом, чтобы она оказалась обжата на донышке 2 тонкими стенками пробирки. Пинцетом переносят пробирку с гранулой в воду, подогревают до 30 45^oC так, чтобы утолщенный ободок выступал над уровнем воды. Покачивая пробирку в воде, оттаивают семя в течение 10 25 с. Пробирку пинцетом извлекают из воды, обтирают салфеткой или ватным тампоном и помещают в штатив.

Одновременно оттаивают только две гранулы в разных пробирках, которые используют для осеменения, например коровы или телки, в течение 15 минут с момента оттаивания гранулы.

Новый способ оттаивания замороженных в гранулах биологических объектов и устройство для его осуществления позволяют исключить из технологии осеменения коров и телок замороженным в гранулах семенем быков-производителей дефицитный реактив лимоннокислый натрий и стеклянные ампулы, сокращает трудоемкость и упрощает технологию осеменения сельскохозяйственных животных.

Заявляемые способ оттаивания замороженных в гранулах биологических объектов и устройство для его осуществления применимы в животноводстве и ветеринарии при разведении сельскохозяйственных животных методом искусственного осеменения, а также в научных исследованиях.

Использование: ветеринария, а именно - способ и устройства для размножения животных методом искусственного осеменения. Сущность изобретения: технический результат изобретения достигается тем, что предложен способ оттаивания биологических объектов, замороженных в гранулах, включающий извлечение гранулы из хладагента, перенесение ее в емкость для помещения в теплоноситель, помещение емкости с гранулой в теплоноситель и оттаивание, отличающийся тем, что после извлечения гранулы из хладагента ее переносят в сухую пробирку из полимерного материала, обжимают пинцетом стенки пробирки над гранулой и помещают в теплоноситель, где выдерживают гранулу до оттаивания. Устройство для оттаивания гранулы выполнено в виде пробирки из полиэтиленовой пленки толщиной 10-40 микрон, высотой от 2 до 5 раз превышающей диаметр гранулы, отверстие пробирки окантовано утолщенным ободком. Изобретение применимо в животноводстве и ветеринарии при искусственном осеменении сельскохозяйственных животных и в научных исследованиях. 2 с.п. ф-лы, 2 ил.

1. Способ оттаивания замороженных в гранулах биологических объектов, включающий извлечение гранулы из хладагента, перенесение ее в емкость для помещения в теплоноситель, помещение емкости с гранулой в теплоноситель и оттаивание, отличающийся тем, что после извлечения гранулы из хладагента ее переносят в сухую пробирку из водонепроницаемого эластичного материала, обжимают пинцетом или другим устройством стенки пробирки над гранулой и помещают пробирку в теплоноситель жидкость, например воду, подогретую до 34 45^oС на 10 25 с. 2. Устройство для оттаивания замороженных в гранулах биологических объектов, включающее емкость для размещения извлеченной из хладагента гранулы и помещения ее вместе с гранулой в теплоноситель, отличающееся тем, что емкость выполнена из эластичного водонепроницаемого материала, например полиэтиленовой пленки, в виде пробирки с толщиной стенок 10 40 мкм, высотой, в 2 5 раз превышающей диаметр гранулы, причем отверстие пробирки окантовано утолщенным ободком, высота которого составляет 1/4 1/7 общей высоты пробирки, а толщина 0,5 1,5 мм, диаметр отверстия пробирки в 1,5 3,0 раза превышает диаметр гранулы.