СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЖИВОЙ ГРИППОЗНОЙ ВАКЦИНЫ Российский патент 1997 года по МПК A61K39/145 

Изобретение относится к медицинской биотехнологии и может быть использовано в производстве противогриппозных препаратов.

Известен способ получения живой гриппозной вакцины (ЖГВ), предусматривающий накопление вакцинного штамма вируса гриппа в культуре ткани с последующим сбором вируссодержащего материала и лиофилизацией (авт. св. СССР N 303806, 1973).

Известен также способ получения ЖГВ путем накопления вируса в аллантоисной полости развивающихся куриных эмбрионов с последующим отделением вируссодержащей аллантоисной жидкости (ВАЖ), стабилизацией и лиофилизацией целевого продукта (авт. св. СССР N 1743270, 1964; патент США N 4338296, 1982). Для предотвращения возможности аллергических реакций ВАЖ осветляют с помощью низкоскоростного центрифугирования (авт. св. СССР N 1125815, 1983).

Однако данные способы не обеспечивают высокой иммуногенности целевого продукта, о чем указано в работах (Руководство по вакционному и сывороточному делу. М. Медицина, 1978, с. 232 236; Шадрин А.С. и др. Сравнительная оценка эффективности массового применения живых и инактивированных гриппозных вакцин. Вакцинопрофилактика и иммунология гриппа. Л. ВНИИ гриппа, 1980, с. 48 55; Зазимко Л.А. Изучение вирулентности вирусов гриппа и факторов, влияющих на ее проявление. Автореф. дисс. д-ра мед. наук, Л. 1987).

Наиболее близким к заявляемому является способ получения ЖГВ, предусматривающий культивирование вируса гриппа в развивающихся куриных эмбрионах, отделение ВАЖ, определение в ней индекса инфекционность (ИА)/гемагглютинин (ГА) и осветление ВАЖ, имеющей значение этого индекса не ниже 7. Далее осветленную ВАЖ дополнительно очищают ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы или микрофильтрацией; полученный вирусный концентрат разводят фосфатным физиологическим буферным раствором (ФФБР) в соотношении 1 3, стабилизируют давлением 5, 6 объема гидролизина, содержащего 0,02% человеческого сывороточного альбумина (ЧСА), подвергают стерилизующему фильтрованию, затем вносят сорбитоло-желатинольный протектор и лиофилизируют (патент РФ N 2033182, 1991).

Однако указанный прототип нетехнологичен: он применим лишь в мелкосерийном производстве, либо в производстве, использующем стерильную ВАЖ (последнее нереально). Для массового же получения вакцины данный способ непригоден, поскольку индекс инфекционность/гемагглютинин можно вычислить только по результатам предварительного определения инфекционной и гемагглютинирующей активности ВАЖ. При этом определение инфекционной активности занимает не менее 2 сут. что общеизвестно (см. например, "Методические указания по проведению контроля противогриппозных препаратов", утвержденные Минздравом СССР 16.11.84). За время контроля инфекционной активности степень бактериальной обсемененности ВАЖ резко увеличивается, вплоть до невозможности ее дальнейшего использования, в частности, из-за повышения содержания бактериальных эндотоксинов. При этом крупносерийное и массовое производство претерпевает значительный экономический ущерб.

Другой недостаток прототипа заключается в возможности внесения контаминирующих агентов при добавлении протектора лиофилизации.

Целью изобретения является повышение технологичности способа путем исключения паузы при обработке ВАЖ на время определения индекса ИА/ГА.

Указанная цель достигается тем, что в варианте способа получения ЖГВ, предусматривающем культивирование вируса гриппа в развивающихся куриных эмбрионах, отделение вируссодержащей аллантоисной жидкости, осветление, очистку ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы, разведение вирусного концентрата фосфатным физиологическим буферным раствором, стабилизацию, стерилизующее фильтрование и лиофилизацию в присутствии сорбитоло-желатинольного протектора,
а) осветление вируссодержащей аллантоисной жидкости проводят непосредственно по мере ее отделения;
б) разведение вирусного концентрата производят до значения обратного титра гемагглютинирующей активности в пределах от 3200 до 6400;
в) протектор лиофилизации вносят перед стерилизующим фильтрованием.

Причинно-следственная связь между внесенными изменениями и достигнутым результатом заключается в следующем.

В прототипе полноценность вирусной популяции вакцины контролируют и обеспечивают по критерию ИА/ГА. Эта операция в предлагаемом способе исключается. Вместо нее проводят на более поздней стадии экспресс-контроль и стандартизацию ГА в вирусном концентрате разведением ФФБР из расчета обратного титра ГА от 3200 до 6400 (в прототипе разведение концентрата ФФБР проводят в 3 раза без учета ГА). Внесенное изменение основано на впервые установленном авторами свойстве фракций вируса гриппа из градиента плотности сахарозы, разведенных из расчета ГА от 3200 до 6400, обеспечить требуемую ИА не менее 6 и 7 lg ЭИД₅₀/0,1 мл для ЖГВ из штаммов типа B и A соответственно (далее объем контролируемой дозы при определении ИА 0,1 мл не указывается). Поскольку этим свойством обладают лишь концентраты, полученные градиентным ультрацентрифугированием, данное изменение в варианте дополнительной очистки микрофильтрацией неприемлемо.

Взаимосвязь ГА вирусных концентратов из различных штаммов, полученных градиентным ультрацентрифугированием, с ИА ЖГВ и ее выходом (объем вакцины в мл из 1 куриного эмбриона) проиллюстрирована в табл. 1.

Как видно из табл. 1, разведение вирусного концентрата до обратного титра ГА в пределах от 3200 до 6400 гарантирует получение целевого продукта с вышеуказанной ИА. Разведение концентрата из расчета ГА>6400 нецелесообразно, поскольку приводит к существенному снижению выхода вакцины. Выход за нижний предел ГА сопряжен с риском получения недостаточной ИА препарата, вплоть до необратимого брака по этому показателю (отмечен прочерком в табл. 1).

Изъятие определения индекса ИА/ГА дает возможность проведения операции осветления сразу после отделения ВАЖ, причем наиболее целесообразно осветлять ВАЖ по мере ее накопления в минимально достаточном для используемого оборудования объеме. Этим самым не только достигается непрерывность технологического процесса, но и прекращается дальнейшее накопление в ВАЖ контаминирующей микрофлоры. В табл. 2 проиллюстрирована зависимость степени бактериальной обсемененности ВАЖ от срока ее хранения при 6^oC. Как видно из табл. 2, хранение собранной ВАЖ перед ее осветлением увеличивает степень обсемененности, в частности, при ее хранении в течении 48 ч, как это имеет место в прототипе, этот показатель увеличивается более, чем в 5 раз.

Изменение последовательности проведения операции добавления сорбитоло-желатинольного протектора лиофилизации и стерилизующего фильтрования выполнено с целью предотвращения возможности попадания контаминирующих агентов в целевой продукт.

Пример 1. 11-дневное развивающиеся куриные эмбрионы заражают в аллантоисную полость штаммом вируса гриппа А/17/Техас/91/1/3 (H1N1). Доза заражения 0,2 мл посевного вируса при 2 lg ЭПИ₅₀. Зараженные эмбрионы инкубируют в течение 48 ч при 32^oC и относительной влажности 70% Затем эмбрионы охлаждают в течение 18 ч при температуре 5^oC и собирают ВАЖ.

Через 30 мин, когда объем собираемой ВАЖ достигается 30 л, запускают процесс ее осветления седиментационной обработкой в проточном роторе ультрацентрифуги при факторе разделения 8000g и скорости протока 40 л/ч. Осветленную ВАЖ собирают в промежуточную емкость, температуру в которой регулируют в диапазоне 6±2^oC. Таким образом, сбор и осветление ВАЖ ведут параллельно и непрерывно.

По достижении объема осветленной ВАЖ 20 л запускают процесс ее очистки проточным ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы, приготовленном на ФФБР pH 7,2, дополнительно содержащем 0,2% ЧСА и 0,01 M MgSO₄, при факторе разделения 90000 g и скорости протока 20 л/ч. По окончании градиентного ультрацентрифугирования производят фракционирование градиента плотности сахарозы. Отбирают и объединяют фракции с содержанием сахарозы от 35 до 48% и ГА не менее 1000. В объединенном вирусном концентрате ГА=16000.

Концентрат разводят из расчета ГА=4000 добавлением 3-кратного (16000: 4000-1= 3) объема ФФБР pH 7, дополнительно содержащего 0,2% ЧСА и 0,01 М MgSO₄. Фактическая ГА равна расчетной.

В разведенный вирусный концентрат добавляют стабилизатор 4,6 объема гидролизина, дополнительно содержащего 0,2% ЧСА, и сорбитоло-желатинольный протектор, содержащий желатиноль и D-сорбит из расчета конечной концентрации по 2,5 мас. каждого ингредиента.

Полученный полуфабрикат имеет ГА=320. Его подвергают стерилизующему фильтрованию через предфильтр и каскад мембран с уменьшающими по ходу потока размером пор: 1,2; 0,8; 0,65; 0,45; 0,22 мм. Стерильный фильтрат разливают по 1,1 мм в ампулы и лиофилизируют из замороженного до 40^oC состояния в вакуум-сушильном аппарате.

Технические характеристики вакцины приведены в табл. 3.

Пример 2. ЖВГ получают из вакцинного штамма вируса гриппа А/17/Шангдонг/91/3/5 (H3N2). Культивирование вируса, отделение ВАЖ, ее осветление и очистку проводят как в примере 1.

Полученный вирусный концентрат имеет ГА=12000. Его разводят из расчета ГА= 3200 добавлением 2,75 объема ФФБР (12000:3200-1=2,75), дополнительно содержащего 0,2% ЧСА и 0,01 М MgSO₄. Фактическая ГА равна расчетной.

В разведенный вирусный концентрат добавляют 4,6 объема гидролизина, дополнительно содержащего 0,2% ЧСА, и сорбитоло-желатинольный протектор из расчета конечной концентрации желатиноля и D-сорбита по 2,5 мас. каждого.

Полученный полуфабрикат имеет ГА=256. Его подвергают стерилизующему фильтрованию и лиофилизируют как в примере 1.

Технические характеристики вакцины приведены в табл. 3.

Пример 3. ЖГВ получают из вакцинного штамма вируса гриппа В/Панама/30/90. Культивирование вируса, отделение ВАЖ, ее осветление и очистку проводят как в примере 1.

Полученный вирусный концентрат имеет ГА=20000. Его разводят из расчета ГА= 6400 добавлением 2,125 объема ФФБР (20000:6400-1=2,125), дополнительно содержащего 0,2% ЧСА и 0,01 М MgSO₄. Фактическая ГА равна расчетной.

В разведенный вирусный концентрат добавляют 4,6 объема гидролизина, дополнительно содержащего 0,2% ЧСА, и сорбитоло-желатинольный протектор из расчета конечной концентрации желатиноля и D-сорбита по 2,5 мас. каждого.

Полученный полуфабрикат имеет ГА= 512. Его подвергают стерилизующему фильтрованию и лиофилизируют как в примере 1.

Технические характеристики вакцины приведены в табл. 3.

Использование предлагаемого изобретения вместо прототипа позволяет упростить и ускорить получение ЖГВ, поскольку изъята длительная операция 48-часового определения ИА исходной ВАЖ, требовавшаяся для отбраковки последней по индексу ИА/ГА.

Положительный эффект, производный от вышеуказанного, заключается в повышении выхода вакцины из единицы сырья (как пояснено в табл. 1 и 3, из одного куриного эмбриона получают 0,4-1,2 мл вакцины с ИА 7,0-8,0 и 6,0-6,6 lg ЭИД₅₀ для вирусов типа А и В соответственно). В прототипном же способе по индексу ИА/ГА забраковывают не менее 90% серий собранной ВАЖ, что свидетельствует о невозможности его промышленного использования и подтверждается прилагаемым актом испытаний.

Помимо вышеуказанных видов достигнутого положительного эффекта, повышена надежность обеспечения стерильности вакцины за счет предотвращения возможности попадания контаминирующих агентов при добавлении протектора лиофилизации, поскольку протектор добавляют на более ранней стадии технологического процесса.

Достигнутая полнота выхода вакцины из всего объема собранной ВАЖ и повышение надежности обеспечения стерильности вакцины имеют следствием соответствующее снижение ее себестоимости.

Использование: медицина, медицинская биотехнология для производства противогриппозных препаратов. Сущность изобретения: способ предусматривает культивирование вируса гриппа в развивающихся куриных эмбрионах, отделение вирусосодержащей аллантоисной жидкости, осветление, очистку ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы, разведение вирусного концентрата фосфатным физиологическим буферным раствором, стабилизацию, стерилизующее фильтрование и лиофилизацию в присутствии сорбитоло-желатинольного проектора. С целью упрощения способа, увеличения выхода вакцины и повышения надежности обеспечения ее стерильности, осветление вируссодержащей аллантоисной жидкости проводят непосредственно по мере ее отделения, разведение вирусного концентрата производят до значения обратного титра гемагглютинирующей активности в пределах от 3200 до 6400, а протектор лиофилизации вносят перед стерилизующим фильтрованием. Использование способа обеспечивает выход 0,4 - 1,2 мл живой гриппозной вакцины из 1 куриного эмбриона. Инфекционная активность целевого продукта - 7,0 - 8,0 и 6,0 - 6,6 Ig ЭИД₅₀/0,1 мл для вирусов типа a и B соответственно. 3 табл.

Способ получения живой гриппозной вакцины, включающий культивирование вируса гриппа в развивающихся куриных эмбрионах, отделение вируссодержащей аллантоисной жидкости, осветление, очистку ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы, разведение вирусного концентрата фосфатным физиологическим буферным раствором, стабилизацию, стерилизующее фильтрование и лиофилизацию в присутствии сорбитоло-желатинольного протектора, отличающийся тем, что осветление вируссодержащей аллантоисной жидкости проводят непосредственно по мере ее отделения, разведение вирусного концентрата производят до значения обратного титра гемагглютинирующей активности в пределах 3200 6400, а протектор лиофилизации вносят перед стерилизующим фильтрованием.