СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЖИВОЙ ВАКЦИНЫ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ГРИППА Российский патент 2006 года по МПК A61K39/145 

Изобретение относится к области медицины и касается способа приготовления вакцины для профилактики гриппа.

Сущность изобретения состоит в том, что вакцина готовится из очищенной вируссодержащей аллантоисной жидкости (ВАЖ) с применением нового стабилизатора и специально подобранного режима лиофилизации и досушивания, по окончании которого камера аппарата заполняется тяжелым инертным газом, например аргоном, вытесняющим воздух из ампул, после чего производится их запайка.

Известен способ получения гриппозной вакцины путем лиофилизации вируссодержащей жидкости в среде пептона, взятого в количестве 4-8%, с последующим ампулированием целевого продукта в условиях осушенного воздуха (авторское свидетельство СССР № 174327, кл. А 61 К 39/145, опубл. 1964 г.).

Недостатком данного способа являются низкая иммунологическая эффективность защиты взрослого населения и возможность аллергических реакций на ее введение.

Известен способ получения живой гриппозной вакцины, включающий культивирование вируса гриппа в развивающихся куриных эмбрионах, отделение вируссодержащей аллантоисной жидкости, стабилизацию и лиофилизацию вирусного концентрата в присутствии протектора, в состав которого входят желатиноль и D-сорбит (патент РФ № 2033182, кл. А 61 К 39/145, опубл. 1995 г.).

Недостатком данного способа является недостаточно должное качество высушивания и снижение сохранности биологических титров вирусов.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому способу является способ получения живой гриппозной вакцины, включающий заражение куриных эмбрионов вакцинными штаммами вируса гриппа, сбор вируссодержащей аллантоисной жидкости, введение стабилизатора, стерилизующую фильтрацию, розлив в ампулы, лиофилизацию и заполнение ампул инертным газом (азотом или аргоном) в процессе их запайки (Фармакопейная статья предприятия ФСП42-0504409704 с регламентом № 1208-02 «Вакцина гриппозная аллантоисная интраназальная живая сухая», ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ, опубл. 2004 г.).

Недостатком указанного способа является то, что использование в качестве стабилизатора пептона, обладающего специфическим вкусом и запахом и являющегося источником повышенного содержания белка в готовой форме вакцины, затрудняет использование препарата для массовой вакцинации против гриппа в связи с возможностью аллергических реакций, а также сложная технология наполнения ампул инертным газом в процессе их запайки.

Техническим результатом предложенного способа является получение вакцины для профилактики гриппа, обладающей уменьшенным содержанием белка, что снижает возможность аллергических реакций, отсутствием специфического запаха и процесс изготовления которой является более технологичным и экономичным.

Технический результат достигается тем, что способ получения живой гриппозной вакцины включает заражение куриных эмбрионов вакцинными штаммами вируса гриппа, сбор вируссодержащей аллантоисной жидкости, введение стабилизатора, стерилизующее фильтрование, розлив в ампулы и лиофилизацию, причем стабилизатор содержит сахарозы - 135 г, лактозы - 90 г, глицина - 30 г, глутамата натрия - 15 г, триса - 5 г, натрия хлорида - 7,5 г и 10%-ный раствор желатины, а процесс лиофилизации ведется при температуре минус 16°С в течение 30 часов с последующим досушиванием препарата при температуре плюс 28°С в течение 16 часов и заполнением ампул тяжелым инертным газом по окончании высушивания, после чего производится их запайка.

Изобретение осуществляется следующим образом:

1. Получение ВАЖ.

1.1. Приготовление рабочего разведения посевного материала.

Работу проводят в асептических условиях. Ампулу сухого маточного материала вскрывают согласно правилам и разводят содержимое 0,1% раствором пептона, приготовленного на 0,05 М трис-буфере рН 7,2±0,2 до указанного на этикетке исходного объема.

С помощью пипетки раствор из ампулы переносят в бутыль с 0,1% раствором пептона, приготовленного на 0,05 М трис-буфере в количестве, определяемом по формуле

V=10^х × объем раствора пептона,

где х - логарифм специфической активности вносимого вируса.

Затем в горлышко бутыли вставляют сифон, к свободным концам которого подсоединяют собранные шприцы-дозаторы. Шприцы-дозаторы предварительно кипятят 45 минут в стерилизаторе, заполненном дистиллированной водой.

После посева содержимого бутыли через шприц-дозатор на тиогликолевую среду берут выемки для контроля специфической активности и рН.

1.2. Заражение эмбрионов.

Эмбрионы на тележках подаются в предбокс, где производится обработка скорлупы 2% спиртовым раствором йода и обжиг горящим спиртовым факелом. Обработанные эмбрионы передают в бокс.

Металлическим пробойником, предварительно обработанным 96% спиртом и обожженным в огне, в скорлупе на тупом конце яйца над воздушной камерой делают прокол. Через полученное отверстие с помощью шприца-дозатора через иглу длиной 22-25 мм и диаметром 1-1,5 мм в каждый эмбрион вводят по 0,2 мл посевного материала.

После парафинирования папки с зараженными эмбрионами поступают в термальные комнаты.

1.3. Инкубация эмбрионов.

Куриные эмбрионы, зараженные вирусом гриппа типа А, инкубируют в течение 48 часов при температуре плюс 32-35°С и влажности 75±5%; эмбрионы, зараженные вирусом типа В, - в течение 72 часов при температуре плюс 32-35°С и влажности 75±5% в термальной комнате.

1.4. Просмотр эмбрионов.

С помощью ручных овоскопов отбирают эмбрионы подвижные, с хорошо развитой кровеносной системой, которые помещают в холодильную камеру. Отбракованные эмбрионы высыпают в металлические баки и обеззараживают.

1.5. Охлаждение эмбрионов.

Охлаждение осуществляют в течение 18±2 часа при температуре плюс 4±2°С.

1.6. Сбор ВАЖ.

Работу проводят в асептических условиях. Поверхность скорлупы эмбрионов обрабатывают горящим спиртовым факелом. Пинцетом, обработанным 96% спиртом и обожженным в пламени, снимают часть скорлупы над воздушным мешком и стерильной пипеткой прокалывают хорионаллантоисную оболочку.

Сбор ВАЖ осуществляют в стерильные пронумерованные флаконы (объем флаконов 0,5 литра). Из каждого флакона делают посев на стерильность и берут выемки для получения объединенной пробы, которую контролируют на подлинность, специфическую активность, отсутствие посторонних вирусов (заражение в аллантоисную полость, на хорионаллантоисную оболочку и в желточный мешок), микоплазм и микобактерий туберкулеза.

ВАЖ, прошедшую контроли (стерильную, подлинную, имеющую инфекционную активность не менее 10^6,5 ЭИД₅₀/0,2 мл для вируса типа А и 10^6,0 ЭИД₅₀/0,2 мл для вируса типа В, не содержащую посторонних вирусов, микоплазм и микобактерий туберкулеза), берут в работу.

2. Получение моновалента вакцины гриппозной аллантоисной интраназальной живой сухой.

2.1. Приготовление стабилизатора.

Для приготовления 1 литра стабилизатора берут навески: сахароза - 135 г, лактоза - 90 г, глицин - 30 г, глутамат натрия - 15 г, трис - 5 г, натрия хлорид - 7,5 г и растворяют в 0,7 л стерильной дистиллированной воды. Подкисляют раствор стабилизатора с помощью 2 М HCl до значения рН 7,3±0,1. Полученный раствор фильтруют через пластины с диаметром пор 0,22 мкм. В процессе фильтрации стабилизатор разливают по 300 мл во флаконы емкостью 0,5 л. Закрывают стерильными пробками, завальцовывают колпачками. Стабилизатор хранят при температуре плюс 2-8°С не более 2-х месяцев.

2.2. Приготовление 10% желатина.

100 г легкоплавкого желатина растворяют в горячей стерильной воде до объема 1 литр, разливают по 200 мл во флаконы емкостью 0,5 л, закрывают стерильными пробками, завальцовывают колпачками и автоклавируют в мягком режиме. (Прогревают 30 минут, автоклавируют при температуре плюс 100°С 20 минут, через 24 часа повторяют операцию автоклавирования. Такой цикл автоклавирования делают три раза).

2.3. Фильтрация ВАЖ на ткани Петрянова.

На этом этапе используется система непрерывной фильтрации, состоящая из фильтрующих модулей. Площадь поверхности зависит от количества ВАЖ, из расчета 50-100 л на 1 м², на этой стадии используются фильтрующие материалы типа тканей Петрянова различных марок, например ФПП 15-9 или любые другие фильтрующие материалы, позволяющие производить очистку с высокой производительностью и не сорбирующие вирус.На вход системы через насос подсоединяют емкость с 3% раствором формалина. В каждой серии разведенного формалина определяют процентное содержание формальдегида. Для стравливания воздуха в процессе заполнения аппарата стерилизующей жидкостью в каждой его секции установлены клапаны пережимные. На последней секции установлен клапан предельно-спускной, который предохраняет аппарат и систему трубопроводов блока от повышения давления сверх допустимого (0,14 МПа). Стерилизацию системы 3% раствором формалина проводят 30-60 мин.

Отмывку проводят 10-объемами стерильной дистиллированной воды с последующим пропусканием через систему стерильного фосфатного буферного раствора (ФБР) до установления значения рН 7,2±0,2.

ВАЖ из флаконов сливают в бутыли по штаммам, подписывают бутыль маркером (штамм, дата слива). При приготовлении моновалента допускается использование ВАЖ от разных дат с возможной предварительной заморозкой до минус 20°С. Допускается хранение не фильтрованной ВАЖ при температуре плюс 2-8°С не более 14 дней. При хранении свыше 14 дней флаконы с ВАЖ помещают в холодильный прилавок с температурой минус 20°С (не более чем на 6 месяцев).

На вход системы через насос подключают емкость со слитой ВАЖ. С выхода отбирают отфильтрованную ВАЖ. Давление при фильтрации до 0,5 атмосфер.

Берут 3 части стабилизатора, подогретого до плюс 37°С, добавляют в него 1 часть 10% желатина, подогретого до плюс 37°С, и тщательно перемешивают. Полученный раствор добавляют при помощи компрессора в 6 частей ВАЖ комнатной температуры (моновалент).

2.4. Стерилизующая фильтрация.

Стерилизующая фильтрация осуществляется через каскад мембран, вымаченных в дистиллированной воде и установленных на рабочей пластине фильтрующей установки в следующем порядке: 0,2 мкм, 0,45 мкм, 1,0 мкм.

Количество установок определяют из расчета 10-14 л фильтруемого материала на один каскад диаметром 0,293 м и площадью 0,067 м² в зависимости от плотности фильтруемого материала.

На вход системы через насос подсоединяют емкость с 3% раствором формалина. В каждой серии разведенного формалина определяют процентное содержание формальдегида. Возврат системы подсоединяют к этой же емкости.

Стерилизацию системы 3% раствором формалина проводят 30-60 минут при непрерывном прокачивании. Отмывку проводят 5 объемами стерильной воды и 10 объемами ФБР до восстановлении рН на выходе установки. Перед началом работы проверяют рН ФБР, который должен быть равен 7,2±0,2.

От входа установки отсоединяют насос и подсоединяют емкость с моновалентом, предварительно подключенную к компрессору или баллону со сжатым воздухом. Выход установки подключают к стерильной емкости для сбора профильтрованного моновалента. Давление при фильтрации до 0,5 атм. Из бутыли берут пробы на стерильность, специфическую активность.

После стерилизующей фильтрации моноваленты помещают в холодильную камеру с температурой плюс 2-8°С.

3. Приготовление готового препарата.

3.1. Сведение моновалентов.

Прошедшие контроль профильтрованные моноваленты штаммов А₁, А₂ и В перекачивают с помощью компрессора в емкость. Объем моновалентов трех различных штаммов A₁, А₂ и В должен быть одинаковым.

Из бутыли берут пробы на контроль стерильности и специфической активности.

3.2. Розлив полуфабриката вакцины гриппозной аллантоисной интраназальной живой сухой.

Работу проводят в асептических условиях. Перед началом работы проводят санитарную обработку боксов, а также контроль бактериальной обсемененности воздуха в рабочем помещении и рук персонала. Розлив вакцины осуществляется с помощью дозатора перистальтического.

Подсоединение трубки от сифона бутыли с вакциной к дозирующей головке с гибким силиконовым шлангом осуществляется с помощью спиртовки и факела под салфеткой, смоченной 6% перекисью водорода. После подсоединения к дозатору проводят коррекцию дозы препарата 3±0,2 (0,5±0,05) мл и делают посев начала розлива на четыре пробирки с тиогликолевой средой и начинают розлив. Во время розлива бутыль с вакциной периодически перемешивают и контролируют на стерильность в середине и в конце розлива. Ампулы укладывают в приемную кассету, установленную в наклонный лоток, под стерильную марлевую салфетку. По окончании розлива кассеты с вакциной промораживают при температуре минус 38±3°С в течение 6 часов и начинают сублимационное высушивание.

3.3. Лиофилизация.

Вакцину замораживают до температуры минус 35°С в течение 5 часов. Включением вакуумного насоса в камере создают разрежение 50±10 мм рт.ст. и поддерживают его в течение 2 часов. После этого включают подогрев до температуры минус 16°С и выдерживают ее в течение 30 часов. Затем отключают регулятор температуры на 6 часов. Далее в течение 15 часов проводят досушивание вакцины при температуре плюс 28°С. После полного высушивания заполняют камеру тяжелым инертным газом, например аргоном, после чего ампулы с готовым препаратом запаивают.

Примеры использования предложенного способа:

Пример № 1

Получение моновалента А₁.

190 штук десятидневных куриных эмбрионов были заражены маточным материалом штамма A₁. После инкубирования в термальной комнате в течение 48 часов при температуре плюс 37°С и охлаждения в течение 18 часов в холодильной камере при температуре плюс 4°С была получена ВАЖ в количестве одного литра со специфической активностью вируса гриппа 10 ЭИД₅₀/0,2 мл.

ВАЖ была подвергнута фильтрации через ткань Петрянова на установке предварительной фильтрации, стерилизованной 3% раствором формалина.

ВАЖ была пропущена через установку стерилизующей фильтрации с фильтром из трех мембран, диаметр пор которых 1 мкм, 0,45 мкм и 0,2 мкм. Установка предварительно была стерилизована 3% раствором формалина.

Специфическая активность вируса гриппа в моноваленте составила 10^7,5 ЭИД₅₀/0,2 мл.

Получение моновалента А₂.

Аналогичным образом было получен один литр ВАЖ со специфической активностью вируса гриппа 10^7,5 ЭИД₅₀/0,2 мл. ВАЖ также была отфильтрована и стерилизована. Специфическая активность вируса гриппа в моноваленте составила 10^7,33 ЭИД₅₀/0,2 мл.

Получение моновалента В.

190 штук десятидневных куриных эмбрионов были заражены маточным материалом штамма В. После инкубирования в термальной комнате в течение 72 часов при температуре плюс 33°С и охлаждения в течение 18 часов в холодильной камере при температуре плюс 4°С была получена ВАЖ в количестве одного литра со специфической активностью вируса гриппа 10^7,5 ЭИД₅₀/0,2 мл. ВАЖ была отфильтрована и стерилизована так же, как и для двух других моновалентов. Специфическая активность вируса гриппа в моноваленте составила 10^7,0 ЭИД₅₀/0,2 мл.

Получение стабилизатора.

Приготовлено 1,5 литра стабилизатора без желатина, который затем был стерилизован так же, как и моноваленты. Отдельно приготовлено 0,5 литра 10% раствора желатина. Раствор желатина автоклавирован при температуре плюс 100°С в течение 20 минут.

Получение полуфабриката.

Моноваленты трех штаммов, имеющие комнатную температуру, сведены в равном количестве в одну бутыль. Стабилизатор и раствор желатина нагреты до температуры плюс 37°С. 0,5 литра раствора желатина прибавлено к 1,5 литрам стабилизатора, после чего раствор тщательно перемешан и добавлен в бутыль со сведенными моновалентами.

Розлив полуфабриката.

Полуфабрикат вакцины был разлит в 16600 ампул по 0,3 мл в каждую.

Лиофилизация и запайка ампул.

Лиофилизация была осуществлена согласно разработанному графику сушки. После окончания процесса высушивания и заполнения ампул аргоном кассеты с ампулами направлены на запайку.

Выход готового препарата составляет 16600 доз вакцины.

Пример № 2.

Сравнительная характеристика снижения специфической активности живой гриппозной вакцины в процессе лиофилизации при использовании предложенного стабилизатора и 13% пептона.

Проведение сравнительного эксперимента.

ВАЖ, объединенная с 13% раствором пептона, разливалась в ампулы в объеме 0,6 мл, а ВАЖ, объединенная с предложенным стабилизатором, - по 0,3 мл. Высушивание препаратов производилось одновременно в одной сублимационной машине. Для определения специфической активности содержимое обоих типов ампул растворяли в одинаковом объеме - 0,5 мл.

Методика определения специфической активности вируса гриппа на куриных эмбрионах.

Определение проводили на развивающихся куриных эмбрионах 10-12-дневного возраста.

Десятикратные разведения вируса готовили в 4,5 мл буферно-солевого раствора рН от 7,4 до 7,0, меняя при каждом разведении пипетку. 0,2 мл ВАЖ из разведении от 10^-5 до 10^-8 (разведения могут меняться в зависимости от целей исследования и предполагаемой специфической активности вируса) вводили в аллантоисную полость, используя на каждое разведение по 4 эмбриона. Для заражения эмбрионов использовали разные шприцы или проводили заражение одним шприцом, начиная с большего разведения.

Эмбрионы инкубировали в течение 48 ч для вируса типа А и 72 ч для вируса типа В при температуре, указанной авторами штамма. По истечении срока инкубации отдельно из каждого эмбриона отобрали по 0,4-0,5 мл аллантоисной жидкости, которую поместили в 4 отдельные лунки плексигласовой панели. Затем в каждую лунку добавили по 0,4-0,5 мл 1%-ной суспензии куриных эритроцитов. Через 30-40 минут контакта при температуре плюс 20±2°С, после оседания эритроцитов в контроле, провели учет гемагглютинации.

Контроль проводили как описано выше, но вместо аллантоисной жидкости из куриного эмбриона в свободные 4 лунки панели вносили по 0,4-0,5 мл буферно-солевого раствора при значении рН 7,2±0,2.

Вычисление биологического титра проводили по методу Рида и Менча. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1СтабилизаторШтаммСпецифическая активность ЭИД₅₀/0,2 млДо сушкиПосле сушкиВакцина с предложенным стабилизатором. Объем 0,3 мл.A₁10^8,010^7,33А₂10^8,010^8,0В10^8,010^8,0Вакцина с пептоном 13%. Объем 0,6 мл.A₁10^8,010^7,33А₂10^8,010^7,66В10^8,010^7,33

Из представленных данных следует, что одна доза вакцины, приготовленная с использованием предложенного стабилизатора, содержит в объеме 0,3 мл такую же специфическую активность, как вакцина, приготовленная с пептоном, в объеме 0.6 мл. Так как для приготовления 0,3 мл вакцины с предложенным стабилизатором необходимо 0,18 мл ВАЖ, а с пептоном - 0,3 мл ВАЖ, то использование нового стабилизатора позволяет в 1,7 раза уменьшить объем ВАЖ, необходимый для производства живой гриппозной вакцины. Таким образом, предложенный стабилизатор является более эффективным для сохранения биологических титров вирусов гриппа по сравнению с пептоном и гораздо более экономичным.

Пример № 3.

Сравнительная характеристика термостабильности стабилизаторов.

Проведение сравнительного эксперимента.

Оба типа ампул (ВАЖ с пептоном 13% и ВАЖ с предложенным стабилизатором) одновременно инкубировались в течение 7 суток при температуре плюс 37°С.

В качестве контроля были использованы ампулы с содержимым, идентичным опыту, но инкубировавшиеся в эти же сроки при температуре плюс 4°С. Методика определения специфической активности вируса гриппа приведена в Примере № 2.

Результата тестирования представлены в таблице 2.

Таблица 2.СтабилизаторШтаммСпецифическая активность ЭИД₅₀/0,2 мл+37°С 7 сутокКонтрольВакцина с предложенным стабилизатором. Объем 0,3 млA₁10^7,010^7,66А₂10^7,510^8,0В10^6,010^7,0Вакцина с пептоном 13% объем 0,6 млA₁10^6,3310^7,66А₂10^6,010^8,0В10^4,6610^6,5

Из представленных данных следует, что вакцина, приготовленная с предложенным стабилизатором, более термостабильна, чем вакцина, приготовленная с пептоном.

Пример №4.

Сравнительная характеристика стабильности специфической активности живой гриппозной вакцины при использовании предложенного стабилизатора и 13% пептона.

Проведение сравнительного эксперимента.

Оба типа ампул (ВАЖ с пептоном 13% и ВАЖ с предложенным стабилизатором) хранились в идентичных условиях (температура плюс 4°С).

Контроль активности вируса гриппа проводился через каждые 3 месяца. Методика определения специфической активности вируса гриппа приведена в примере № 2.

Результаты тестирования представлены в таблице 3.

Таблица 3СтабилизаторШтаммСпецифическая активность ЭИД₅₀/0,2 млИсход3 месяца9 месяцев12 месяцевВакцина с предложенным стабилизатором объем 0,3 млA₁10^8,010^7,6610^7,510^7,0А₂10^8,3310^7,510^7,010^7,0В10^7,510^7,010^6,6610^6,33Вакцина с пептоном 13% объем 0,6 млA₁10^8,3310^7,6610^7,010^6,5А₂10^7,510^7,010^6,510^6,5В10^7,010^6,6610^6,510^6,0

Из представленных данных следует, что вакцина, приготовленная с предложенным стабилизатором, в течение срока хранения препарата сохраняет специфическую активность лучше, чем вакцина, приготовленная с пептоном.

Таким образом, использование предложенного стабилизатора и специального режима лиофилизации позволяет более эффективно проводить процесс высушивания с максимальным сохранением биологических титров вирусов гриппа, входящих в состав живой гриппозной вакцины. Благодаря этому, для приготовления одной вакцинирующей дозы вакцины стало возможным использовать 0,18 мл ВАЖ вместо 0,3 мл, как в способе-прототипе, а также уменьшить количество производственных операций контроля, что приводит к экономической выгоде. Кроме того, в качестве белкового носителя в стабилизаторе использован высокоочищенный желатин, не имеющий ни цвета, ни запаха и содержащий белка на порядок меньше, чем пептон, что существенно с точки зрения неспецифической реактогенности.

Изобретение относится к области биотехнологии. Способ включает заражение куриных эмбрионов вакцинным штаммом вируса гриппа, сбор вируссодержащей аллантоисной жидкости, введение стабилизатора, стерилизующее фильтрование, розлив в ампулы и лиофилизацию. При этом стабилизатор содержит навески из сахарозы - 135 г, лактозы - 90 г, глицина - 30 г, глутамата натрия - 15 г, триса - 5 г, натрия хлорида - 7,5 г, растворенные в 0,7 л стерильной дистиллированной воды и смешанные с 10%-ным раствором желатина в соотношении 3:1. В процессе лиофилизации ампулы с вакциной выдерживают в течение 5 часов при температуре минус 35°С, причем первые 2 часа при атмосферном давлении 50±10 мм рт.ст., далее в течение 30 часов - при температуре минус 16°С. После чего регулятор температуры отключают на 6 часов, а затем в течение 15 часов проводят досушивание при температуре плюс 28°С с последующим заполнением ампул аргоном и их запайкой. Полученная вакцина содержит пониженное количество белка, что снижает возможность возникновения аллергических реакций, и процесс ее изготовления является более технологичным и экономичным. 3 табл.

Способ получения живой вакцины для профилактики гриппа, включающий заражение куриных эмбрионов вакцинным штаммом вируса гриппа, сбор вируссодержащей аллантоисной жидкости, введение стабилизатора, стерилизующее фильтрование, розлив в ампулы, лиофилизацию и заполнение ампул инертным газом, отличающийся тем, что стабилизатор включает навески из сахарозы - 135 г, лактозы - 90 г, глицина - 30 г, глутамата натрия - 15 г, триса - 5 г, натрия хлорида - 7,5 г, растворенные в 0,7 л стерильной дистиллированной воды и смешанные с 10%-ным раствором желатина в соотношении 3:1, а в процессе лиофилизации ампулы с вакциной выдерживают в течение 5 ч при температуре минус 35°С, причем первые 2 ч при атмосферном давлении (50±10) мм рт.ст., далее в течение 30 ч при температуре минус 16°С, после чего регулятор температуры отключают на 6 ч, а затем в течение 15 ч проводят досушивание при температуре плюс 28°С с последующим заполнением ампул аргоном и их запайкой.