ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БИФИДОБАКТЕРИЙ Российский патент 1997 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в производстве бифидумбактерина.

Подбор дешевой питательной среды, соответствующей физиологическим потребностям микроорганизмов, является одной из основных задач в производстве бактериальных препаратов, нормализующих микрофлору.

Известны широкоприменяемые питательные среды для культивирования бифидобактерий казеиново-дрожжевая (КД-5), среда Блаурокка, гидролизованное молоко (ГМ) и другие. Основным недостатком этих сред является то, что для их приготовления используются натуральные пищевые продукты (говяжья печень, дрожжи, молоко), а также такие дорогостоящие компоненты как пептон и L-цистин.

Одним из путей удешевления питательных сред является использование для их приготовления компонентов, не имеющих пищевой ценности. Известна питательная среда "Бактофет" (патент РФ N 2002801, кл. C 12 N 1/20), включающая в состав лактозу, натрий хлористый, агар-агар, ферментативный гидролизат мышечной ткани плодов коров 6-8-месячного возраста, и/или свиней, 2,5-3-месячного возраста, и/или овец последних сроков суягности. Она содержит в качестве питательной основы ферментативный гидролизат мышечной ткани плодов коров, свиней и овец последних сроков беременности.

Однако забой животных (особенно коров и свиней) на таких сроках беременности нерентабелен и не носит массового характера, а забой суягных овец для получения каракульчи осуществляется в среднеазиатских республиках, что создает трудности с получением сырья для приготовления питательной среды.

Предлагается в качестве основы питательной среды использовать гидролизат молозивной казеиново-сывороточной массы из отходов производства лактоглобулина.

Известно, что белки молозива по своему составу занимают промежуточное положение между белками молока и сыворотки крови, они содержат большое количество аминокислот, в том числе незаменимых. Наличие в составе белков молозива в достаточном количестве цистина позволит отказаться от дополнительного введения аминокислот в питательную среду.

Молозивная казеиново-сывороточная масса является отходом производства в процессе получения лактосыворотки из молозива коров. Из 35 л молозива получают (24,5±1) л лактосыворотки, при этом остается около (9,3±2) кг казеиновой массы, содержащей до (1,5±0,5) л сыворотки (производственный регламент 328 91 "Лактоглобулин противоколипротейный коровий сухой для перорального применения").

Получение гидролизата молозивной казеиново-сывороточной массы: 100 г молозивной казеиново-сывороточной массы заливают 1 л дистиллированной воды, тщательно перемешивают, с помощью 25%-ного водного раствора аммиака доводят pH до 8,0. Смесь выдерживают при комнатной температуре 2 3 ч, затем добавляют 1 г панкреатина. После тщательного перемешивания смесь помещают в термостат при 45^oC. В течение первых 2 ч через каждые 30 мин доводят pH смеси до 8,0 с помощью 25%-ного водного раствора аммиака. Через 4 ч выдерживания смеси в нее добавляют хлороформ в количестве 10 мл и оставляют в термостате при 45^oC на 18 ч. После окончания инкубации с помощью 30%-ного раствора уксусной кислоты pH смеси доводят до 4,5. Помешивая кипятят 2- 3мин. Охлаждают и фильтруют через миткалевый фильтр. Готовый гидролизат стерилизуют при 110^oC в течение 30 мин. Готовый гидролизат содержит полипептиды высокой, средней и низкой молекулярной массы. Свободные аминокислоты в следующих количествах (мкг/мл) аспарагин 11,7; треонин 6,49; серин 8,62; глутамин 29,5; пролин 0,8; глицин 2,58; аланин 6,08; валин 9,4; метионин 5,15; изолейцин 8,36; лейцин 30,6; тирозин 18,6; фенилаланин 16,1; гистидин 4,6; лизин 19,9; арганин 11,2; цистеин 5,41. Показатели содержания аминного азота 70 110 мг
Питательная среда включает сернокислое железо, хлористый натрий, аскорбиновую кислоту, глюкозу; агар-агар, содержит в качестве источника азотистых соединений гидролизат молозивной казеиново-сывороточной массы при следующем содержании компонентов в граммах на 1 л среды:
Железо сернокислое 0,002 0,1
Натрий хлористый 4,0 6,0
Глюкоза 8,0 12,0
Агар-агар 0,75 1,0
Аскорбиновая кислота 0,8 1,0
Гидролизат молозивной казеиново-сывороточной массы Остальное.

Пример 1. Берут 0,002 сернокислого железа, 4 г хлористого натрия, 0,75 агар-агара, 0,8 г аскорбиновой кислоты, 8 г глюкозы, добавляют гидролизат молозивной казеиново-сывороточной массы до 1 л. С помощью 25%-ного водного раствора аммиака устанавливают pH 7,2 7,4. Стерилизуют при 110^oC в течение 30 мин.

Пример 2. Берут 0,005 сернокислого железа, 5 г хлористого натрия, 0,8 г агар-агара, 1 г аскорбиновой кислоты, 10 г глюкозы, добавляют гидролизат молозивной казеиново-сывороточной массы до 1 л. Доводят pH до показаний 7,2 - 7,4 с помощью 25%-ного водного раствора аммиака. Стерилизуют при 110^oC в течение 30 мин.

Ростовые свойства приготовленной питательной среды проверяли, используя штамм бифидобактерий B. bifidum-1, полученный из ГИСК им. Л.А. Тарасевича и используемый в производстве эубиотического препарата "Бифидумбактерин".

Бифидобактерии штамма B. bifidum-1 засевали на питательную среду в соотношении посевной материал и питательная среда 1:10. Посевы выдерживали в термостате при (38±1)^oC в течение 40 ч, после чего в них определяли количество низнеспособных микроорганизмов.

Количество низнеспособных бифидобактерий на предлагаемой среде сопоставлялось с их количеством на эталонной среде Блаурокк при их выдерживании в течение 48 ч. Результаты представлены в таблице.

Как видно из данных таблицы, изменение содержания остальных компонентов питательной среды существенно не отражается на ростовых свойствах. Ростовые свойства питательной среды с оптимальным соотношением компонентов не уступают ростовым свойствам среды Блаурокка.

Пример 3. Берут 0,01 сернокислого железа, 6 г хлористого натрия, 1,0 г агар-агара, 1,2 г аскорбиновой кислоты, 12 г глюкозы, добавляют гидролизат молозивной казеиново-сывороточной массы до 1 л. С помощью 25%-ного водного раствора аммиака устанавливают pH 7,2 7,4. Стерилизуют при 110^oC в течение 30 мин.

Пример 4. Проведено изучение влияния питательной среды на основе гидролизата молозивного казеина на морфологические и культуральные свойства бифидобактерий B. bifidum-1. Обнаружено, что при выращивании бифидобактерий B. bifidum-1 на предлагаемой питательной среде морфологические, культуральные и биологические свойства бифидобактерий штамма B. bifidum-1 соответствуют требованиям, изложенным в ФС 42 132 ВС-88 "Бифидумбактерин сухой".

В мазках из культур, выросших на предлагаемой питательной среде бифидобактерии штамма B. bifidum-1, имели типичную морфологию палочки средних размеров, грамположительные с раздвоением одного из концов, располагаются в виде кучек, напоминающих рога оленя или китайские иероглифы, а также в виде отдельных особей. При выращивании на предлагаемой питательной среде в пробирках в высоком столбике через 72 ч роста при (38±1)^oC образуют колонии в виде комет, гвоздиков, зерен с образованием верхней стерильной зоны. Бифидобактерии, выращенные на предлагаемой питательной среде, обнаруживают антагонистическую активность по отношению к 3 штаммам возбудителей дизентерии (2 культуры S. flexner, 1 культура S Sonne). 2 штамма протея, энтеропатогенных кишечных палочек и золотистого стафилококка. Активность кислотообразования их составляет 100 120^o по Тернеру.

Таким образом, предлагаемая питательная среда на основе гидролизата молозивной казеиново-сывороточной массы из отходов производства лактоглобулина обеспечивает хорошее развитие бифидобактерий штамма B. bifidum-1 с сохранением их типичных морфологических, культуральных и биологических свойств. Для получения среды используются отходы производства лактоглобулина, что существенно снижает ее себестоимость и позволяет организовать безотходное производство.

Использование: биотехнология и может быть использовано в производстве бифидумбактерина. Подбор дешевой питательной среды, соответствующей физиологическим потребностям микроорганизмов, является одной из основных задач в производстве бактериальных препаратов, нормализующих микрофлору. Сущность изобретения: питательная среда включает железо сернокислое, натрий хлористый, аскорбиновую кислоту, глюкозу, агар-агар, содержит в качестве источника азотисных соединений ферментативный гидролизат молозивной казеиново-сывороточной массы при следующем содержании компонентов в граммах на 1 л среды: железо сернокислое 0,002 - 0,1, натрий хлористый 4,0 - 6,0, глюкоза 8,0 - 12,0, агар-агар 0,75 - 1,0, аскорбиновая кислота 0,8 - 1,2, ферментативный гидролизат молозивной казеиново-сывороточной массы - остальное. Бифидобактерии, выращенные на предлагаемой питательной среде, обнаруживают антагонистическую активность по отношению к 3 штаммам возбудителей дизентерии (2 культуры S. flexner, 1 культура S. Sonne). 2 штамма протея, энтеропатогенных кишечных палочек и золотистого стафилококка. Активность кислотообразования их составляет 100 - 120^o по Тернеру. Таким образом предлагаемая питательная среда на основе гидролизата молозивной казеиново-сывороточной массы из отходов производства лактоглобулина обеспечивает хорошее развитие бифидобактерий штамма B. bifidum-1 с сохранением их типичных морфологических, культуральных и биологических свойств. 1 табл.

Питательная среда для культивирования бифидобактерий, содержащая источник азотистых соединений, источник углерода, хлористый натрий и агар-агар, отличающаяся тем, что в качестве источника азотистых соединений она содержит гидролизат молозивно-казеиново-сывороточной массы, источника углерода - глюкозу и дополнительно аскорбиновую кислоту и железо сернокислое в качестве стимуляторов роста при следующем соотношении компонентов, г/л среды:
Железо сернокислое 0,002 0,01
Натрий хлористый 4,0 6,0
Глюкоза 8,0 12,0
Аскорбиновая кислота 0,8 1,2
Агар-агар О,75 1,0
Ферментативный гидролизат молозивно-казеиново-сывороточной массы - Остальное до 1 лт