ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ГРИБОВ РОДА CANDIDA Российский патент 2007 года по МПК C12N1/14 C12R1/72 

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно медицинской микробиологии, и может быть использовано для выделения микроскопических дрожжеподобных грибов рода Candida из материала от людей при исследовании на дисбактериоз кишечника, влагалища и других отделов организма человека.

Известны питательные среды для выделения микроскопических дрожжеподобных грибов рода Candida: мясопептонный глюкозный агар, среда Сабуро, пивное сусло-агар, морковный агар, морковно-картофельный агар и др. Эти среды многокомпонентные, содержат трудно поддающиеся стандартизации растительные ингредиенты, готовятся на основе пищевых продуктов. Они достаточно сложны в приготовлении, не всегда дают воспроизводимые результаты и не характеризуют биологические свойства.

Известна питательная среда Сабуро (П.Н.Кашкин с соавт. Определитель патогенных, токсигенных и вредных для человека грибов. Л.: Медицина, 1979, с.50), имеющая следующий состав, г/л: пептон - 10; глюкоза - 40; агар микробиологический - 18; вода дистиллированная - 1000 мл. Приведенная питательная среда проста в изготовлении, но не дает представления о биологических свойствах изучаемых микроорганизмов, таких как филаментирующая способность, свидетельствующая о потенциальной патогенности грибов для человека.

Целью настоящего изобретения является создание новой дешевой питательной среды для выделения микроскопических дрожжеподобных грибов рода Candida и изучения их филаментирующей способности.

Настоящая цель достигается тем, что в качестве питательной основы используют ферментативный гидролизат молозивной казеиново-сывороточной массы (молозивного творога) из отходов производства лактоглобулина. Предлагаемая питательная среда состоит из следующих ингредиентов (в соотношении в г/литр готовой среды):

Пептон4,9-5,0Глюкоза19,8-20,0Натрия хлорид4,9-5,0Агар микробиологический15,0-15,1Ферментативный гидролизат молозивной казеиново-сывороточной массы (молозивного творога) из отходов лактоглобулина499-500Дистиллированная водаОстальноеФурациллин1:10000 (0,1 г)

Молозивный творог является отходом при производстве лечебного препарата лактоглобулина в процессе получения лактосыворотки из молозива коров. "Из 35 литров молозива получают (24,5±1) л лактосыворотки, при этом остается (9,3±2) кг молозивного творога, содержащего до (1,5±0,5) л сыворотки" (производственный регламент №328-91) "Лактоглобулин противоколипротейный коровий сухой для перорального применения). Молозивный творог должен иметь соотношение казеин-сыворотка не менее 7:3, рН не ниже 4,1±0,2.

Молозивный творог помещают в 5-литровую бутыль, разбавляют дистиллированной водой из расчета 100 грамм массы на 1 литр дистиллированной воды, хорошо перемешивают, доводят рН 25% водным раствором аммиака до рН 8,0, добавляют панкреатин (МРТУ 425946-84) в количестве 0,1 г на литр смеси, вновь хорошо перемешивают и помещают смесь в термостат при температуре 45±1°С на 3±0,5 часа. В течение инкубации каждый час смесь перемешивают, доводя рН до 8,0 с помощью 25% водного раствора аммиака. По истечению 3-х часов гидролиз останавливают, изменяя рН смеси до значений 4,3 с помощью уксусной кислоты. Смесь прогревают до закипания и выдерживают при такой температуре 3-5 минут, затем охлаждают и фильтруют через миткалевый фильтр. Показатель аминного азота готового ферментативного гидролизата молозивного творога, определяемый методом формольного титрования, находится в пределах 0,15-0,25%. Полученный ферментативный гидролизат молозивного творога стерилизуют автоклавированием при 1 атм в течение 30 минут. Стерильный ферментативный гидролизат молозивного творога годен к употреблению в течение 3-х месяцев.

Приготовление раствора фурациллина производят ex tempore из стандартной аптечной формы. Для этого 1 г фурациллина разводят дистиллированной стерильной водой до 10 мл (маточный раствор 1:10). Маточный раствор берут затем в соотношении 1 мл на 1000 мл среды (0,1 г фурациллина на 1,0 л дистиллированной воды). Раствор фурациллина введен в среду для угнетения роста сопутствующих микроорганизмов. Внесение раствора фурациллина производят непосредственно перед разливом среды в чашки Петри.

Пример 1.

Среда с максимальным содержанием компонентов.

К 0,5 литра ферментативного гидролизата молозивной казеиново-сывороточной массы) из отходов лактоглобулина (ферментативный гидролизат молозивного творога) последовательно добавляют глюкозы 20 г, хлорида натрия 5,0 г, пептона 5,0 г, агара микробиологического 15,1 г. Объем среды доводят до 1,0 л дистиллированной водой.

После внесения всех компонентов измеряют рН, доводят до значения 6,4-6,6, разливают по флаконам и стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм в течение 15 мин.

Перед посевом среду расплавляют, охлаждают до 45°С и вносят 1 мл раствора фурациллина (1:10000) (0,1 г фурациллина на 1,0 л дистиллированной воды), затем разливают в чашки Петри.

Пример 2.

Среда с оптимальным содержанием компонентов.

К 0,5 литра ферментативного гидролизата молозивного творога последовательно добавляют глюкозы 20 г, пептона 5 г, хлорида натрия 5 г, агара микробиологического 15,0 г. Объем среды доводят до 1,0 л дистиллированной водой.

После внесения всех компонентов измеряют рН, доводят до значения 6,4-6,6, разливают по флаконам и стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм в течение 15 мин.

Перед посевом среду расплавляют, охлаждают до 45°С и вносят 1 мл раствора фурациллина (1:10000) (0,1 г фурациллина на 1,0 л дистиллированной воды), затем разливают в чашки Петри.

Пример 3.

Среда с минимальным содержанием компонентов.

К 0,499 литра ферментативного гидролизата молозивного творога последовательно добавляют глюкозы 19,8 г, хлорида натрия 4,9 г, пептона 4,9 г, агара микробиологического 15,0 г.Объем среды доводят до 1,0 л дистиллированной водой.

После внесения всех компонентов измеряют рН, доводят до значения 6,4-6,6, разливают по флаконам и стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм в течение 15 мин.

Перед посевом среду расплавляют, охлаждают до 45°С и вносят раствор фурациллина 1 мл (1:10000) (0,1 г фурациллина на 1,0 л дистиллированной воды), затем разливают в чашки Петри.

Пример 4.

Определение ростовых свойств.

Ростовые свойства среды определяют по отношению к типовому штамму Candida albicans по сравнению со средой Сабуро - прототип.

Сравнительные данные ростовых свойств трех вариантов предлагаемой среды изложены в таблице 1.

Приведенные в таблице результаты свидетельствуют, что на предлагаемой среде Candida albicans растут лучше, чем на типовой среде Сабуро.

Пример 5.

Использование среды для выращивания дрожжеподобных грибов рода Candida.

Среда с ферментативным гидролизатом молозивного творога использована для обеспечения роста разных видов дрожжеподобных грибов рода Candida (Candida albicans, C.parapsilosis, C.brumptii, С.intermedia). Проводили посев микроорганизмов в виде микробной взвеси 100 м.т. на 1 чашку Петри.

Полученные результаты приведены в таблице 2.

Как видно из представленных данных, полученная среда с ферментативным гидролизатом молозивного творога обеспечивает рост разных видов дрожжеподобных грибов рода Candida в количествах, несколько превышающих количество их на среде Сабуро.

Пример 6.

Возможность практического использования среды для диагностики дисбактериозов кишечника у людей.

Изучено использование среды с ферментативным гидролизатом молозивного творога для выделения дрожжеподобных грибов рода Candida из фекалий людей с дисбактериозом. Производили параллельный посев фекалий в разведениях от 10^-1 до 10^-4 на стандартную среду Сабуро и предлагаемую среду на основе ферментативного гидролизата молозивного творога. Результаты представлены в таблице 3.

Приведенные результаты указывают, что использование среды с ферментативным гидролизатом молозивного творога позволяет выявить дрожжеподобных грибов рода Candida в фекалиях людей с дисбактериозом в достоверно частых случаях, чем среда Сабуро.

Пример 7. Изучение угнетающей способности питательной среды для выделения дрожжеподобных грибов рода Candida на возможные сопутствующие микроорганизмы.

Сопоставляли угнетающую способность питательной среды на основе ферментативного гидролизата молозивного творога на тест-штаммы Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Corynebacterium xerosis.

Производили посев тест-штаммов с помощью шпателя на питательную среду для выделения дрожжеподобных грибов рода Candida и контрольные среды (Сабуро, Эндо, кровяной теллуритовый агар и мясопептонный агар) в виде микробной взвеси 100 м.т. на 1 чашку Петри.

Полученные результаты представлены в таблице 4.

Среда на основе ферментативного гидролизата молозивного творога оказывала угнетающее действие на рост тест-штаммов, аналогично среде Сабуро. В то время как контрольные питательные среды показали хороший рост всех тестируемых микроорганизмов.

Пример 8. Изучение угнетающей способности питательной среды для выделения дрожжеподобных грибов рода Candida на рост лактобактерий.

Предлагаемая питательная среда для выделения дрожжеподобных грибов рода Candida получена на основе ферментативного гидролизата молозивного творога аналогично среде для выделения лактобактерий (АС №2202609) с изменением ряда ингредиентов.

Изучена угнетающая способность предлагаемой среды на Lactobacterium sp. (50 штаммов). Посев культур лактобактерий проводили шпателем параллельно на поверхностях испытуемой среды и среды для выделения лактобактерий в количестве 100 м.т. на 1 чашку Петри.

Полученные результаты представлены в таблице 5.

Результаты показали, что предлагаемая среда для выделения дрожжеподобных грибов рода Candida угнетала рост всех штаммов лактобактерий, в то время как на контрольной среде для выделения лактобактерий был отмечен качественный рост испытуемых культур.

Пример 9.

Изучение гемолитической активности дрожжеподобных грибов.

Была изучена гемолитическая активность дрожжеподобных грибов рода Candida у 40 штаммов грибов, выделенных от людей с дисбактериозами кишечника. После пяти пассажей на предлагаемой питательной среде гемолитическая активность была изучена повторно. Результаты исследования представлены в таблице 6.

Как представлено в таблице, совпадение признака наблюдали у 100% дрожжеподобных грибов. Стимуляции появления признака не было выявлено.

Пример 10.

Изучение филаментации дрожжеподобных грибов рода Candida.

Основными питательными средами для стимуляции филаментации дрожжеподобных грибов считаются рисовая или картофельная среды. Проведено изучение стимуляции филаментации дрожжеподобных грибов рода Candida параллельно на предлагаемой питательной среде, рисовой среде и среде Сабуро. Изучены Candida sp. (40 штаммов) в двух повторностях: исходные штаммы и штаммы пассированные пятикратно на предлагаемой среде.

В таблице 7 представлены полученные результаты. Как показано в таблице, дрожжеподобные грибы на среде Сабуро филаментирующей способностью обладали слабо. Рисовая среда и среда на основе ферментативного гидролизата молозивного творога давали аналогичные результаты при 100% совпадении наличия признака. При этом наблюдалась стимуляция свойства при культивировании грибов на обеих средах по сравнению со средой Сабуро. Но стимуляция признака не была обнаружена после пятикратного пассажа на предлагаемой среде.

Таким образом, предлагаемая питательная среда проста в изготовлении, содержит доступные компоненты. Использование отходов производства лактоглобулина позволяет изготавливать среду в больших количествах. Предлагаемая питательная среда не влияет на биологические свойства грибов (ростовые характеристики и гемолитическую активность) и позволяет при первичном анализе на дисбактериоз судить о филаментирующей способности дрожжеподобных грибов рода Candida, что свидетельствует об их патологическом потенциале.

Таблица 1Ростовые свойства среды для выделения грибов с основой ферментативного гидролизата молозивного творогаСредыСодержание живых особей (абс. число) серии экспериментов123Среда с минимальным содержанием компонентов6·10^-38·10^-37·10^-3Среда со средним содержанием компонентов5·10^-48·10^-44·10^-4Среда с максимальным содержанием компонентов4·10^-42·10^-45·10^-4Среда Сабуро2·10^-32·10^-33·10^-3

Таблица 2Количество дрожжеподобных грибов рода Candida при выращивании на среде с ферментативным гидролизатом молозивного творогаПитательная средаСодержание живых особей абс. число/штаммовC.albicansC.parapsilosisC.brumptiiС.intermediaСреда с ферментативным гидролизатом молозивного творога98±0,497±0,496±0,597±0,4Среда Сабуро86±1,585±1,684±1,685±1,6

Таблица 3Количество дрожжеподобных грибов рода Candida в фекалиях больных с дисбактериозом кишечника при посевах на среду Сабуро и среду с ферментативным гидролизатом молозивного творогаСредаКоличество обследованныхКоличество дрожжеподобных грибов рода Candida КОЕ/г при посеве из разведения 10^-3Среда с гидролизатом молозивного творога1855,97±0,18Среда Сабуро1853,42±0,1

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской микробиологии. Питательная среда содержит пептон, глюкозу, натрия хлорид, агар микробиологический, ферментативный гидролизат молозивной казеиново-сывороточной массы из отходов производства лактоглобулинов, дистиллированную воду и фурациллин. Изобретение позволяет получить дешевую и качественную питательную среду для выделения грибов рода Candida. 7 табл.

Питательная среда для выделения грибов рода Candida, содержащая пептон, глюкозу, агар микробиологический, дистиллированную воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит ферментативный гидролизат молозивной казеиново-сывороточной массы из отходов производства лактоглобулинов, натрия хлорид и фурациллин при следующем содержании компонентов, г/л:

Пептон4,9-5,0Глюкоза19,8-20,0Натрия хлорид4,9-5,0Агар микробиологический15,0-15,1Ферментативный гидролизат молозивной казеиново-сывороточной массы из отходов производства лактоглобулинов499-500Фурациллин1:10000 (0,1 г)Дистиллированная водаОстальное