ШТАММ BACILLUS SUBTILIS - ПРОДУЦЕНТ РИБОФЛАВИНА (ВАРИАНТЫ) Российский патент 1997 года по МПК C12P25/00 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, конкретно к микробиологическому синтезу рибофлавина.

Рибофлавин (витамин В₂) применяется в животноводстве, звероводстве, и птицеводстве (свиньи, куры, пушные звери) в качестве кормовой добавки. Кристаллический рибофлавин используют в пищевой и фармацевтической промышленности.

В мировой практике для получения рибофлавина микробиологическим способом используют грибной продуцент. Известен штамм Eremothecium ashbyii "ВНИИгенетика 1906" [1] который на соевой среде с гидролом и кукурузным экстрактом накапливает за 96 ч роста при 20^oС 1,9 г/л рибофлавина. Главным недостатком грибного продуцента является большая продолжительность процесса ферментации.

Известны штаммы Bacillus subtilis, обладающие сверхпродукцией рибофлавина [2] и характеризующиеся разрегулированным биосинтезом пуринов и рибофлавина, а также инверсией и амплификацией рибофлавинового оперона на хромосоме Bacillus subtilis. При использовании сложных питательных сред, содержащих глюкозу, мальтозу, дрожжевой экстракт, кукурузный экстракт, фосфаты калия, глютамат и цитрат натрия, соли Мg⁺⁺, Ca⁺⁺, Mn⁺⁺, Fe⁺⁺⁺, янтарную кислоту и др. а также введения в ферментер углеводной подпитки при помощи компьютера в режиме поддержания определенного уровня растворенного кислорода (15±5) в культуральной жидкости эти штаммы способны накапливать 13-14 г/л рибофлавина за 48 ч и 15 г/л за 56 ч. Недостатком этого процесса является то, что высокие показатели достигаются только при применении дорогих и дефицитных компонентов питательной среды и сложной технологии.

Разработан микробиологический способ получения рибофлавина на основе штаммов Bacillus subtilis ВНИИгенетика 304 и 304а [3] полученных с помощью генетических и селекционных методов, включающих получение мутантов, устойчивых к аналогу рибофлавина-розеофлавину, объединение мутаций по операторной и регуляторной областям с помощью генетической трансформации, ступенчатый отбор с использованием мутагенов. Недостатком этих штаммов является относительно низкий уровень синтеза рибофлавина, достигающий 1,0 г/л.

В авторском свидетельстве СССР N 1429568 [4] описан штамм Bacillus subtilis "ВНИИгенетика 24/рМХ45", созданный на основе штамма Bacillus subtilis "ВНИИгенетика 304а". Этот штамм, рассматриваемый в качестве прототипа, получен генетико-селекционными и генно-инженерными методами, включающими получение регуляторных и других мутантов, конструирование гибридной плазмиды, несущей рибофлавиновый оперон Bacillus subtilis, введение данной плазмиды в реципиентный штамм Bacillus subtilis, обеспечение экспрессии рибофлавинового оперона в составе плазмиды клетки хозяина. При выращивании штамма в глубинных условиях при температуре 37-42^oС и аэрации на среде, содержащей в качестве источников углерода глюкозу или сахарозу, зеленую патоку или мелассу, источников минерального азота мочевину или соли аммония, аммиачную воду, минеральные соли и ростовые факторы, например, сухую биомассу дрожжей, БВК, дрожжевой экстракт, пептон, гидролизат казеина в культуральной жидкости накапливается 6,0 г/л рибофлавина за 48-50 ч роста.

В случае применения способа получения рибофлавина, описанного в авторском свидетельстве СССР N 1561513 [5] достигается увеличение коэффициента конверсии источника углеводов в рибофлавин и снижение количества посторонних примесей в культуральной жидкости. Способ включает культивирование штаммов-продуцентов вида Bacillus subtilis в глубинных условиях при перемешивании и аэрировании на ферментационной среде, содержащей источники углерода, азота, ростовые вещества и минеральные соли, при этом источник углерода в ферментационную среду подают с постоянной скоростью 1-3 г/л в час.

Недостатком штамма-прототипа ВНИИгенетика 24/рМХ45 является относительно невысокая биосинтетическая активность в колбах и в ферментерах с применением описанного выше способа.

Целью изобретения является получение высокоактивного штамма-продуцента витамина В у бактерий вида Bacillus subti- lis.

Поставленная цель достигается получением новых штаммов Bacillus subtilis Биореактор-1 А3, коллекционный номер 2159 и Биореактор-1 ST12, коллекционный номер 2160 в Коллекции культур микроорганизмов Государственного научного центра по антибиотикам (ГНЦА), которые за 72 ч роста при температуре 37-43^oС в условиях перемешивания и аэрации накапливают при культивировании в колбах до 7,2 г/л рибофлавина. В лабораторном ферментере при ведении процесса с подпиткой по способу [5] в культуральной жидкости накапливается до 12 г/л рибофлавина за 50-60 ч.

Новые штаммы получены с применением генетико-селекционных методов из исходного штамма Bacillus subtilis ВНИИгенетика 24/рМХ 45 и несут мутации с изменениями пуринового биосинтеза. Мутанты отбирали по признакам: устойчивость к аналогам пуринов 8-азагуанину и 6-меркаптопурину; адениновая ауксотрофность (АЗ) и реверсия к прототрофности (ST12). В результате были получены штаммы Bacillus subtilis Биоректор-1 АЗ (2159) и Биореактор-1 ST12 (2160), уровень продуктивности которых достигает 7,2 г/л в колбах и 12 г/л в ферментерах, что на 20-90% больше в сравнении с прототипом Bacillus subtilis ВНИИгенетика 24/рМХ45.

Получение рибофлавина с помощью штаммов Bacillus subtilis 2159 и 2160 осуществляют следующим образом: Полутора- или двухсуточную культуру, выращенную на косяке МПА, переносят в колбы с посевной средой, содержащей мелассу или сахарозу, биомассу дрожжей и минеральные соли. Посевной материал выращивают 12-20 ч при 37-40^oС в условиях аэрации и в количестве 1-5% передают в основную ферментационную среду. Можно засевать ферментационную среду, минуя стадию посевной среды смывом с косяка (титр клеток в ферментационной среде после засева 10₅. Ферментационная среда содержит в качестве источника углеводов глюкозу, или патоку, или сахарозу, или мелассу, в качестве ростовых факторов высушенную биомассу дрожжей, или дрожжевой экстракт, или пептон, или гидролизат казеина, источники минерального азота, например, мочевину, соли аммония, аммиачную воду, минеральные соли - соли магния, марганца, железа и др. Ферментацию осуществляют при температуре 37-43^oС при перемешивании и аэрации. Через 48-72 ч ферментации штаммов Биореактор-1 А3 (2159) и Биореактор ST12 (2160) в среде накапливается 5-7,2 г/л рибофлавина в колбах и 8-12 г/л в лабораторном ферментере.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. 2-суточную культуру штамма 2159, выращенную в термостате при 37^oС на агаризованной среде МПА, содержащей 20 мкг/мл эритромицина, петлей переносят в колбы Эрленмейера объемом 750 мл, содержащие по 25 мл ферментационной среды. Состав ферментационной среды, мас.ч. сахароза 10, биомасса дрожжей 2, MgSO₄ 0,05; мочевина 0,6. Ферментацию осуществляют на качалке 240 об/мин при 40^oС в течение 72 ч. Концентрация рибофлавина в культуральной жидкости составляет 5 г/л.

Пример 2. Двухсуточную культуру штамма 2160, выращенную в термостате при температуре 37^oС на агаризованной среде МПА, содержащей 20 мкг/мл эритромицина, петлей переносят в колбы Эрленмейера, содержащие 25 мл ферментационной среды. Состав среды и условия ферментации, как в примере 1. Концентрация рибофлавина в культуральной жидкости составляет 7,2 г/л.

Пример 3. Двухсуточную культуру штамма 2159, выращенную в термостате при температуре 37^oС на скошенной агаризованной среде МПА с 20 мкг/мл эритромицина петлей переносят в посевную среду, разлитую по колбам Эрленмейера (750 мл) в количестве 50 мл. Состав посевной среды, мас. сахароза 2, биомасса дрожжей 1, сернокислый магний 0,05, мочевина 0,3. Через 16 ч культивирования в колбах на качалке при 37^oС производят засев ферментационной среды в лабораторном ферментере типа "Marubishi" объемом 1,2 л (начальный рабочий объем 0,7 л). Состав ферментационной среды, мас. биомасса дрожжей (БВК) 2, сернокислый магний 0,05, пеногаситель (ниоген) 0,1. После засева ферментацию осуществляют при аэрации (1:1), перемешивании (700-1000 об/мин), температуре 41±1^oС и постоянной подаче подпитки в виде раствора мелассы (концентрация около 50%) со скоростью около 2 г/л в час. Через 60 ч культивирования в среде накапливается 12 г/л рибофлавина.

Пример 4. Двухсуточную культуру штамма 2160, выращенную в условиях, как в примере 3 на посевной среде переносят в ферментационную среду, как в примере 3. Через 50 ч культивирования в среде накапливается 12 г/л рибофлавина.

Предлагаемые штаммы 2159 и 2160 на аналогичных прототипу средах обеспечивает уровень синтеза рибофлавина на 20-90% больше по сравнению с штаммом-прототипом ВНИИгенетика 24/рМХ45.

Использование: микробиологическая промышленность. Сущность изобретения: генетико-селекционным путем получены новые мутантные штаммы Bacillus subtilis, характеризующиеся устойчивостью к аналогам пуринов. Каждый из полученных штаммов имеет дополнительные признаки: адениновой ауксотрофности (2159) и реверсии к прототрофности (2160). Культивирование этих штаммов позволяет получать в колбах до 7,2 г/л и в ферментерах до 12 г/л рибофлавина на питательных средах, содержащих в качестве источника углерода сахар, или глюкозу, или патоку, или мелассу. 2 с. п. ф-лы, 1 табл.

1. Штамм Bacillus subtilis ГНЦА 2159 продуцент рибофлавина. 2. Штамм Bacillus subtilis ГНЦА 2160 продуцент рибофлавина.