ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS - ПРОДУЦЕНТ ТИМИДИНА Российский патент 1997 года по МПК C12N1/20 C12P19/40 C12N1/20 C12R1/07 

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологической промышленности и касается прямого микробиологического синтеза тимидина.

Тимидин (2'-тиминдезоксирибонуклеозид) пиримидиновый дезоксирибонуклеозид является структурным компонентом дезоксирибонуклеиновых кислот. Он используется в качестве исходного соединения для химического синтеза азидотимидина единственного на сегодняшний день эффективного средства для терапии болезни СПИД. Кроме того, тимидин и его производные имеют большие перспективы использования в медицине при создании лекарственных препаратов антимикробного и антиканцерогенного действия, а также как реактив при проведении научных исследований в области биологии и сельского хозяйства.

В промышленных масштабах тимидин получают путем ферментативного гидролиза дезоксирибонуклеиновой кислоты, выделенной из молок лососевых и сельдевых рыб, с последующим отделением тимидина от других дезоксирибонуклеозидов и азотистых оснований [1] Недостатками данного способа являются: сезонность поступления сырья (молок), его ограниченная доступность, необходимость применения дорогостоящих препаратов (специфических ферментов-нуклеаз) для гидролиза ДНК, высокая стоимость конечного продукта. Кроме того, масштабное получение тимидина данным способом может нанести существенный ущерб экологии ценных пород промысловых рыб.

Известны штаммы бактерий, относящихся к родам Escherichia, Bacillus, Arthrobacter, Flavobacterium, Micrococcus и др. осуществляющие трансформацию 2'-дезоксирибозо-1-фосфата и тимина до тимидина [2,3] Недостатком этих штаммов является то, что в качестве исходного сырья для получения тимидина применяются весьма дорогостоящие соединения, что приводит к удорожанию целевого продукта.

Для производства тимидина более рентабельной является технология прямого микробиологического синтеза. Известен штамм Brevibacterium L-17 [4] который продуцирует 1,9 г/л тимидина и 2 г/л тимина за 168 ч на питательной среде, содержащей глюкозу (15), дрожжевой экстракт (1), минеральные соли, витамины (тиамин: кальция пантотенат, биотин, фолевую кислоту), а также целый ряд микроэлементов. Недостатками данного штамма являются низкий выход тимидина и длительность ферментации. Задача изобретения получение нового штамма, обеспечивающего повышение выхода тимидина, получаемого путем прямого микробиологического синтеза на дешевых и простых по составу средах и сокращение времени ферментации.

Поставленная задача достигается созданием штамма Bacillus amyloliguefaciens КГМ-5, способного продуцировать до 4,5 г/л тимидина за 96 ч ферментации на среде, содержащей, глюкозу 12; БВК 3,4; NH₄NO₃ 2,5; MgCl₂ 0,5; CaCO₃ 2.

Штамм КГМ-5 получен с применением современных генетико-селекционных методов с использованием структурных аналогов природных пиримидинов, в частности, 5-фторурацила, 5-фторуридина, 5-фтордезоксиуридина. Отбор проводили путем ступенчатой селекции к возрастающим концентрациям указанных аналогов.

Штамм Bacillus amyloliquefaciens КГМ-5 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов и имеет регистрационный номер ВКПМ В-6843.

Культурально-морфологические признаки.

Грамположительная палочка длиной 4-5,5х0,6-0,8 мкм, со сниженной подвижностью и способностью к спорообразованию (эффективность споруляции 0,1х10^-7 спор/мл). На полноценных агаризованных средах (агары: L, мясопептонный, Хоттингера) через 24-48 ч инкубации при 34-37^oC образует колонии беловато-кремового цвета с изрезанным краем, диаметром 1 2,5 мм. Посев штрихом на агаре Хоттингера дает после 24 ч при 34 37^oC умеренный рост, цвет кремовый.

Физиолого-биохимические признаки.

Облигатный аэроб. При инкубации в полноценной жидкой среде наблюдается поверхностный рост. При посеве уколом в полноценный 0,7 агар растет на поверхности. При интенсивной аэрации наблюдается интенсивный рост, без встряхивания клетки лизируются. Для роста на жидкой или агаризованной синтетических средах клетки продуцента требуют аденин, гистидин, тирозин, аспарагин и тиамин. Желатину разжижает, растет на крахмальном агаре и обезжиренном молоке, клетчатку не разрушает и не усваивает, нитраты не восстанавливает.

В качестве единственных источников углерода усваивает глюкозу, фруктозу, маннозу, глицерин, цитрат, сахарозу, лактозу, галактозу, сукцинат, пируват, фумарат. Плохо усваивает рибозу, ксилозу, глюконат.

Отношение к источникам азота. Усваивает азот в форме аммонийных солей (аммоний сернокислый, аммоний азотнокислый и др.).

Отношение к температуре. Растет при температуре от 25 до 40^oC. Оптимальная температура 34-37^oC.

Отношение к pH среды. Растет при pH от 6,5 до 8,5. Оптимальное значение pH 7,3.

Чувствителен к антибиотикам: пенициллину, стрептомицину, рифампицину, неомицину. Устойчив к 5-фторурацилу, 5-фторуридину, 5-фтордезоксиуридину.

Штамм КГМ-5 является ауксотрофом по аденину, гистидину, тиамину и неполным ауксотрофом по аспарагину и тирозину. Обладает сниженной активностью пиримидиннуклеозидфосфорилазы и цитидиндезаминазы. Совокупность перечисленных мутаций в штамме КГМ-5 приводит к сверхпродукции тимидина. Антагонистических свойств не имеет, не патогенен.

За 96 ч ферментации образует 4,5 г/л тимидина. Кроме тимидина штамм КГМ-5 в значительном количестве (до 5 г/л) продуцирует такое ценное соединение, как дезоксицитидин.

Штамм поддерживают на полноценных агаризованных средах (Хоттингера, мясо-пептонный агар) в течение 7-10 сут. Для длительного хранения используют ампулы с лиофильновысушенными клетками.

Пример. Культуру штамма Bacillus amyloliquefaciens КГМ-5 выращивают в течение 24 ч при 34-37^oC на полноценной агаризованной среде Хоттингера, затем культуру засевают в колбы емкостью 750 мл, содержащие 50 мл посевной среды следующего состава, г/л: глюкоза 20; пептон 10; дрожжевой экстракт 10; натрий хлористый 2,5; вода дистиллированная до 1 л; pH 7,2 7,5. Колбы устанавливают на термостатируемую круговую качалку (200-240 об./мин) и выращивают посевной материал в течение 24 ч при 34^oC.

Выращенный посевной материал в количестве 5-10 об. вносят в колбы емкостью 750 мл, содержащие 30 мл ферментационной среды следующего состава, г/л: глюкоза 120; БВК 34; аммоний азотнокислый 25; магний хлористый 5; мел 20; вода дистиллированная до 1 л; pH 7,2-7,5. Процесс ферментации осуществляют на круговой качалке (240-260 об./мин) при 34^oC.

Через 96 ч ферментации в культуральной жидкости накапливается 4,5 г/л тимидина и до 10 г/л других нуклеозидов (в том числе 5 г/л дезоксицитидина).

Аналитический контроль содержания тимидина в культуральной жидкости, а также сопутствующих ему других нуклеозидов осуществляли методом тонкослойной хроматографии на отечественных ТСХ-пластинках Sorbfil. Визуализацию пятен на хроматограммах осуществляли с помощью ультрахемископа Брумберга (длина волны
254 нм). Идентификацию гомогенности веществ, находящихся в пятках и соответствующих по хроматографической подвижности стандартам тимидина, дезоксицитидина и других нуклеозидов осуществляют с помощью ВЭЖХ после элюции с пластинки этих соединений.

Анализ продуктов, накапливающихся в культуральной жидкости проводили также методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЗЖХ), основанном на разделении нуклеозидов с последующим диодно-матричным детектированием и последующей идентификацией по временам удержания и спектральным характеристикам. Разделение проводят на обращенно-фазной колонке с элюентом, содержащим уксусную кислоты, триэтиламин и ацетонитрил. Пробы разводят в 10 раз элюентом. Количественную обработку проводят методом абсолютной калибровки.

Литература.

1. Advanced Org.Chem. Third Bd. John Wiley, N.Y. 1985, p.390.

2. Патент Японии N 1104190.

3. Патент Японии N 2023882.

4. Европейский патент N 344937.

Использование: биотехнология, микробиологическая промышленность, микробиологическое производство тимидина. Сущность изобретения: новый штамм Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-6843, продуцирующий до 4,5 г/л тимидина за 96 ч. ферментации на среде, содержащей глюкозу, дрожжи кормовые - паприн, аммоний азотнокислый, магний хлористый, мел. Штамм устойчив к 5-фторурацилу, 5-фторуридину, 5-фтордезоксиуридину и является ауксотрофом по аденину, гистидину, тиамину и неполным ауксотрофом по тирозину и аспарагину.

Штамм бактерий Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-6843 продуцент тимидина.