Способ получения рибофлавина Советский патент 1984 года по МПК C12P25/00 

Изобретение относится к микробио логической промышленности, а именно к способу получения рибофлавина (В,). Витамин В, 2 пмроко используется в сельском хозяйстве, в основном в качестве кормовых добавок сельскохозяй ственным животным, а кристаллический рибофлавин применяется в пищевой и фармацевтической промышленности. Рибофлавин ползгчают химическим способом, а также путем микробиологического синтеза. Известен способ микробиологического производства рибофлавина путем использования культуры гриба Егеmothecium ashbyii на соевой ферментационной среде, содержащей тидрол и кукурузный экстракт f 1J. За 96 ч процесса ферментации накапливается до 2000 мг/л В,. К недостаткам такого способа следует отнести длитель ный период роста культуры, вследстви чего увеличивается продолжительност . ферментации,и поБЬЩ1енную чувствитель кость к загрязнению посторонней микрофлорой. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения рибофлавина витамина Bj путем культивирования его продуцентов-микроорганизмов вида Bacillus subtilis на питательной среде, содержащей 8% глюкозы в качестве источника углерода, мине-раль ные соли и источники ростовых вещес дрожжевой экстракт, пептон, глутами новую кислоту, препараты РНК, пурины и аналоги пуринов 2 . За 44 ч процесса ферментации накапливалось до 560 мг/л рибофлавина. Недостатками способа является сравнительно низкий уровень активно ти, достигаёмьй культурой Bacillus .subtilis и необходимость в дорогосто щих и дефицитных компонентах фермен тационной и ростовой сред. Целью изобретения является повышение выхода рибофлавина. Поставленная цель достигается тем, что в способе получения рибофл вина, предусматривающем глубинное культивирование продуцирующих его . микроорганизмов вида Bacillus subtilis в условиях аэрации на питател ной среде, содержащей источник угле рода, азота, необходимые минеральны соли в присутствии источников ростовых веществ, в качестве продуци22. рующих рибофлавин микроорганизмов из вида Bacillus ,subtilis используют| штамм Bacbillus subtilis ВНИИгёнетика-304 или ВНИИгенетика-304а. При этом культивирование ведут на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода сахар-сырец или мелассу, а в качестве источников ростовых факторов используют белково-витаминный концентрат или его гидролизат или автолизат, или пищевые дрожжи, или дрожжевой экстракт. Используемые штаммы-сверхсинтетики сконструированы генетическими методами из независимо полученных мутаций, каждая из которых приводит к сверхсинтезу витамина: ros - ribc - AGR (устойчивость к розеофлавину ros, мутация в генерегуляторе ribs, устойчивость к 8-азагуанину AGH). Затем проводилась мутагенная обработка нитрозогуанидином, нитрозометйлмочевйной, облучение ультрафиолетом и селекция активных вариантов на ферментационной среде. Штамм ВНИИгенетика-304-прототроф, штамм ВНИИгенетика-304а - ауксотроф с неидентифицированной ростовой потребностью. Оба штамма олигоспорогенные, на всех средах количество спор по сравнению с исходным штаммом снижено на 3-4 порядка. Способ осуществляют следующим образом. Культуру ВНИИгенетика-304 или ВНИИгенетика-304а выращивают на агаризованной среде Хоттингера или мясо-пептонном агаре (МИЛ) в течение 1-2 суток при температуре 28-37С. Затем суспензию клеток передают в колбы с посевной средой, содержащей мелассу, БВК и минеральные соли, либо в картофельную посевную среду, либо МПБ. Посевной материал выращивают в течение 17-24 ч на качалке 200 об/мин. Затем посевной материал передают в количестве 5-10% в основную ферментационную среду. Процесс ферментации осуществляют в колбах Эрленмейера на качалке, либо в ферментере при интенсивном перемеши вании и аэрации в течение 46-50 ч при температуре , рН 6,5-7,5 (в начале ферментации) на питательной среде, содержащей источники углерода, например глюкозу, сахароЗУ, сахар-сырец, Мелассу, крахмал; источники минерального азота, например соли аммония, мочевины нитра ты;, соли фосфора, например, фосфата калия, аммония и другие соли; соли (MnCl2, MnSO), а также источники ростовых факторов, например, биомассу кормового дрожжевого белка (БВК), гидролизаты и автолизаты БВК пищевые дрожжи, дрожжевой экстракт, кукурузную и соевую муку, кукурузньш экстракт., гидролизат казеина, пептон. Через 46-50 часов ферментации в культуральной жидкости накапливается 700-1000 мг/л рибофлавина. Пример 1. Односуточную кул туру Bacillus subtilis ВНИИгенетика-304, вьфащенную на косяках МПА, пересеивают на жидкую посевную среду, содержащую 6% мелассы, 1% БВК и минеральные соли .Посевная среда готовится разведением пополам стериль ной водой ферментационной среды, состав которой приведен ниже. Вьфащивание посевного материала проводят в колбах Эрленмейера, объемом 750 МП (объемсреды 25-100 мп), на качалке 200 об/мин при в течение 17 часов и передают в количестве 10% в ферментационную среду следующего состава, %: Меласса БВК . (NH)2SO 0,2 1,4 0,6 КН2Р04 0,01 , (цитрат Na) 0,1 РН 7,0-7,2. Ферментацию осуществляют в колбах Эрленмейера, объемом 750 мл (объем среды 25 мл) на качалке 209 ПР 37°С. Через 48 ч фер ментации культуральная жидкость содержит 700-1000 мг/л рибофлавина. Пример 2. Аналогичен приме

ру 1, только используют штамм Bacilfus subtilis-304a.

Пример 3. В качестве продуцента также 1спользуют штаммы ВНИИгенетика/304. Ферментационная среда и условия ферментации, как указано в примере 1. Отличием является состав посевной среды, которая готовится следующим образом. Картофель очищают от кожуры, режут на куски и заливают небольшим количеством воды, после чего стерилизуют при 0,8-1 атм. Посевную среду заМаксимальный выход рибофлавина в предлагаемом способе составляет 1000 мг/л за 48 ч роста культуры на синтетических или комплексных средах, что на 40% превосходит активность штаммов-прЗдуцентов в прототипе. Кроме того, в отличие от указанного прототипа, используют более простые среды, не содержапще дорогостоящих компонентов.

Получение рибофлавина прехшагаемым способом обладает рядом преимуществ по сравнению с действую- 24 севагот с косяков МПА, культура растет в колбах на 750 мл (объем среды 50-100 мл) на качалке при 37С в течение 24 ч. Ферментацион-о ную среду засевают 10% посевного материала, ферментацию проводят, как в примере 1. Через 48 ч ферментации культуральная жидкость содержит 700-1000 мг/л рибофлавина. Пример 4. Так же как в примере 3, только используют щтамм Bacillus subtilis-304a. Пример 5. Культура, посевная среда, условия ферментации, как в примерах 1,2 и 3. Отличием является состав ферментационной среды,%: . Сахароза (или сахар-сырец) 12-14 БВК.,,. 3-4 Минеральные соли, как в примере 1. Через 48 ч ферментации культуральная жидкость содержит 7001000 мг/л рибофлавина. Пример 6. Односуточную культуру штамма ВНИИгенетика-304 с косяков МПА переносят в посевную среду МПБ, на которой 8-10 ч на качалке при готовится-посевной материал. В количестве 10% посевной материал переносится в ферментационную среду, имеющую состав, %: Глюкоза 8 Дрожжевой экстракт Гидролизат казеина или пептон Минеральные как в примере 1. рН 7,1-7,2. Ферментация длится 44-50 ч при в колбах на качалке 200 об/мин. Через 48 ч ферментации культуральная жидкость содержит 700-1000 мг/л рибофлавина. щими в настоящее время произвол- ством рибофлавина с помощью аскомицета Eremotheaum ushbyii (базоВЫ4 способом). Помимо уже упоминавшейся меньшей требовательнос к составу питательных сред в пред лагаемом способе почти вдвое сокращается время ферментации (48 ч

Культурапьно-морфологическая характеристика штаммов-продуцентов рибофлавина Вас. subtilis ВНИИгенетика-304 и ВНИИгенетика-304а. Штамм ВНИИгенетика-304 Морфология под микроскопом Морфология на разных средах Мясо-пептонный агар (МПА) Мясо-пептонный бульон (МПБ)

На 2 сутки роста обрасредаглюкозой зует колонии диаметром 2-3 мм, ярко-желтого цвета, флоурисцируют в УФ-лучах желтым цветом, колонии круглые с гладким краем-, блестяпще Физиологические свойства

Не растет на минимальной среде Штамм ВНИИгенетика-304а Спорообразующая граммположительйая палочка длиной 2-3 На 1-2 сутки роста при 28-37 с образует колонии с неровным краем, звездчатые,диаметром 3-4 мм, поверхность гладкая, блестящая, цвет желтоватьй. Рост по уколу умеренный, в основном на поверхности среды -. Рост без качания на поверхности бульона в виде пленки. Растет при 20-42 С, оптимум 37С рН 5,0-9,0, оптимум 7,0-8,О. Углеводы: хорошо утилизируют глюкозу, сахарозу, крахмал. Спирты: утилизируют этанол, сорбитол Источники азота: хорошо усваивает аммоний, мочевину, нитраты. Желатину разжижает. вместо 72-96 ч), а также уменьшается возможность загрязнения культуры посторонней микрофлорой. По сравнению с прототипом предлагаемый способ характеризуется более высоким 5фовнем выхода прод1гкта и возможностью использовать простые и доступные по составу среды.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РИБОФЛАВИНА путем глубинного культивирования продуцирующих его микроорганизмов вида Bacillus subtilis в условиях аэрации на.питательной среде. содержащей источник углерода, азота, необходимые минеральные соли в присутствии источников ростовых веществ, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода рибофлавина, в качестве продуцирующих рибофлавин микроорганизмов из вида Bacillus;subtilis используют штамм Bacillus subtilis ВНИИгенетика-304 или ВНИИгенетика-304а 2, Способ ПОП.1, отличающийся тем, что культивирование ведут на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода сахар-сырец или мелассу, а в качестве источников ростовых факторов используют белково-витаминный концентрат или его гидролизат или автолизат,или пищевые дрожжи, или дрожжевой экстракт.