Питательная среда для выращивания термофильных бактерий из рода BacILLUS Советский патент 1987 года по МПК C12N1/20 C12N1/20 C12R1/07 

И;и1брртение относится к микробиологической промышленности и к генетическим исследовлниям и может быть использовано при создании генетически маркированных штаммов термофильных бактерий, для создания штаммов- продуцентов пкстраклеточных ферментов .

Цель изобретения - удешевление среды и обеспечение возможности получения ауксотрофных мутантов,

Изобретение заключается в том, что среда для выращивания термофильных бацилл содержит глюкозу, минералные компоненты и воду в следующем соотношении компонентов, г/л:

Аммоний серно-кислый 2,0-2,3 Натрий хлористый 0,31-0,34 Аммоний углекислый однозамещенный0,9-1,1

Калий фосфорнокислый двузамещен- ный1,1-1,3

Магний серно-кислый 0,19-0,21 Кальций хлористый 0,02-0,03 Трис(гидроксиметил)- аминометан (гидрохлорид)5,8-6,4 Глюкоза4,8-5,2 Вода дистиллированная До 1 л Среда пригодна для обнаружения и идентификации ауксотрофных мутантов для поддержания роста термофильных бацилл, для селекции штаммов-продуцентов экстраклеточных ферментов.

Количественное и качественное сочетание компонентов среды позволяет обеспечивать рост термофильных бацилл в отсутствие аминокислот и витаминов. Среда менее трудоемка в приготовлении, чем прототип вследствие более простого состава, а также значительно дешевле из-за отсутствия в ее составе аминокислот и витаминов.

Пример 1. Для получения среды смешивали стерильные растворы компонентов со стерильной водой в следующей последовательности: вода дистиллированная 918,3 мл; аммоний серно-кислый 10%-ный раствор 21,5 мл; натрий хлористый 10%-ный раствор 3,3 мл; аммоний углекислый однозамещенный 1()%-ный раствор 10,0 мл; калий фосфорно-кислый двузамещенный 10%-ный раствор 12,0 мл; трис-НС1 рН 7,0, I М раствор 20,0 мл; магний серно-кислый 10%-ный раствор 2,0 мл

3391252

кальций хлористый 5%-ный раствор 0,4 мл; глюкоза 40%-ный раствор 12,5 мл,

Далее клетки термофильных микроорганизмов следующих видов: Bacillus thermonon- liguefaciens TRl/l

(ЩтМ-В2575)

5

Bacillus thermonon- liguefaciensДГ-9

(Ц ВТМ-В2945)

Bacillus calidus TRl Bacillus subdenti- culatus Matzuchita TRj Bacillus reductans FeirerTR,

Bacillus thermoali- mentophilus Wein- zizlTR9,

e

Bacillus tostus

TR9,

21

5

0

Bacillus stearothermophilusTRl 1 ; TR23;

TR25

Bacillus michaelisi

PrickettTR12

Bacillus nitrosus

CampbellTR15

высевали на чашки Петри, содержащие Q ту же среду с добавлением очищенного агара до 20 г/л. После инкубации в течение 20 ч при 65 С выросшие на поверхности агара колонии еще 4 раза пересевали на свежие чашки с агари- зованной средой, инкубировали по 20 ч при 65°С для истощения пищевых компонентов, которые могли находиться в первичном посевном материале. Наличие роста определяли визуально по появлению колоний.

Аналогичный опыт был проведен при температуре инкубации 70 С, В результате было показано, что рост всех исследуемых штаммов не был подавлен при длительном культивировании на новой среде при 65 - 70°С, тогда как известная среда описана только как среда для культивирования Bacillus stearotbermophilus и Bacillus coagu

lans при 60 С,

Пример 2, Клетки Bacillus therraononliguefaciens ТР1/1 подвергали воздействию Ы-метил-К -нитро-N- нитрозогуанидина, после чего высева- ли на чашки Петри со средой, приготовленной, как в примере 1, но содержащей дополнительно 5 г/л пептона и 5 г/л дрожжевого экстракта. После инкубации в течение 16 ч при 65°С вы- 1

росшие на поверхности агара кoлqнии перепечатывааи на чашки Петри с той же средой, не содержавшей петона и дрожжевого экстракта. Путем добавления к среде различных аминокислот полученные мутанты были идентифицированы следующим образом:

ауксотрофные по

гистидину8 штаммов

ауксотрофнме по

аспарагину1 штамм

ауксотрофные по

орнитину1 штамм.

Таким образом, предлагаемая среда дает возможность получать различные ауксотрофные мутанты термофильных бактерий, в том числе мутанты, ауксотрофные по гистидину, что невозможно при использовании известной среды.

Пример 3. 1мл суспензии клеток Bacillus thermononliguefacien ТР 1 / 1 , подвергнутых воздействию N-ме тил-N -нитро-Ы-нитрозогуанидина, разводили в 100 раз средой, приготовлен ной, как в примере 1, но содержащей вместо глюкозы 5 г/л казеина. Клетки помещали в 100 пробирок, которые инкубировали в течение 16 ч при 65°С. Содержимое пробирки с максимашьным гидролизом казеина рассеивали на чашки Петри, содержавшие предлагаемую среду с добавлением 5 г/л казеина и 20 г/л агара. После инкубации в течение 20 ч и последующего просмотра нескольких тысяч колоний был обнаружен мутант, продуцирующий на 20% болше экстраклеточной протеазы, чем исходный штамм, т.е. среда может быть использована для селекции штаммов микроорганизмов, продуцирующих повышенное количество экстраклеточньгх гидролитических ферментов, в данном Случае - протеаз.

Пример 4. Для приготовления среды использовали следующий состав компонентов, г/л: (Ш)2Й04 2,4; NaCl 0,35; 1,2; KjHP04 1,4; MgSO 0,22; СаСЦ 0,04; трис(гидрок- симетил) аминометан НС1 6,5; глюко- за 5,3; вода дистиллированная до 1л

Способ приготовления питательной среды тот же, что в примере 1.

Вскоре после приготовления питательной среды было отмечено выпаде- ние осадка солей, Использование ага- ризованной среды указанного состава привело к резкому замедлению скорости роста всех исследованных видов

g

5 0

5 о

5

5

5

254

бактерий. Данное замедление роста выражалось в том, что после 1-х суток инкубации при 60-70°С наблюдался рост бактерий в виде точечных микроколоний, на 2-е сутки инкубации размер данных микроколоний не увеличивался, При пересеве микроколоний на свежие чашки с указанной средой роста бактерий не наблюдали.

Таким образом, увеличение концентрации компонентов среды приводит к выпадению части из них в осадок, что делает среду практически непригодной для рдста микроорганизмов при повышенной температуре.

Пример 5. Для приготовления среды использовали следующий состав компонентов, г/л: (Ш)2 50 1,9; NaCl 0,30;МН4НСОз 0,8; 1,0; MgSO 0,18; CaCl 0,01; трис(гидрок- симетил) аминометан (гидрохлорид, рН 7,0) 5,7; глюкоза 4,7; вода дистиллированная до 1 л.

Способ приготовления питательной среды тот же, что и в примере I. Использование агаризованной среды данного состава привело к тому, что скорость роста бактерий заметно уменьшилась, и колонии микроорганизмов вырастали только к 3-м суткам инкубации при 60-70°С, однйко, поскольку к данному сроку инкубации наблюдалось также высыхание агара на чашках, то выросшие колонии были нежизнеспособны.

Таким образом, уменьшение концентраций компонентов питательной среды приводит к резкому замедлению скорости роста бактерий, что затрудняет, а в случае использования агаризованной среды делает невозможным генетическую работу с термофильными микроорганизмами. Формула изобретения

г Питательная среда для выращивания термофильных бактерий из рода Bacil- lus, содержащая глюкозу в качестве источника- углерода, источники азота, натрий хлористый, калий фосфорнокислый двузамещенный, магний сернокислый, кальций хлористый и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что, с целью удешевления среды и обеспечения возможности получения ауксотрофньгх мутантов, среда содержит аммоний серио-кислый и аммоний углекислый однозамещенный в

13

качестве источников азота и допспни- тельно трис(гидроксиметил) аминомеп ая (гидрохлорид) при сле ;ую1цем соотношении компонентов, г/л:

Глюкоза4,8-5,2

Аммоний серне- .

кислый2,0-2,3

Натрий хлористый 0,31-0,3

Аммоний углекис-

лый однозамещенный

0,9Редактор А. Шаядор

Составитель К. Воробьева

Техред М.ДидыкКорректор И. Зрдейи

Заказ 4183/17Тираж 499Подписное

Госудпрстпеиногч) KONiHTeTa СССР

по делам изоГфетений п открытий 113033, Моем.а, Ж-35, Раушская паб., д. 4/5

Производстнгн1и1-1И1-|игра 4)ИЧ1;г-кое предприятие, i . Ужгород, v;i. Проектная, 4

Калий фоесЪорнокислый друтамещеиный

Мат няй серно-кислый

Налтьций хлористый

Трис (т идроксиметил) аминометан

(гидрохлорид)

Йода дисти.чпированная

Изобретение относится к микробиологической промьпиленности и генетическим исследованиям и может быть использовано при создании генетически маркированных штаммов термофильных бактерий для селекции штаммов- продуцентов экстраклеточных ферментов. Целью изобретения является удешевление среды и обеспечение возможности выявления ауксотрофных мутантов термофильных бацилл по всем известным аминокислотам и витаминам. Поставленная цель достигается применением среды, содержащей нижеперечисленные компоненты в следующих соотношениях, г/л: аммоний сернокислый 2,0- 2,3; натрий хлористый 0,31-0,34; аммоний углекислый однозамещенный 0,9- 1,1; калий фосфорно-кислый двузаме- щенный 1,1-1,3; магний серно-кислый 0,19-0,21; кальций хлористый 0,02- 0,03; трис(гидроксиметил) аминометан (гидрохлорид, рН 7,0) 5,8-6,4; глюкоза 4,8-5,2; вода дистиллированная - остальное. Данная среда может использоваться также для генетических работ с термофильными микроорганизмами нескольких видов, § (Л оо 00 со to ел