СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ГЕНОМНОЙ ДАКТИЛОСКОПИИ Российский патент 1997 года по МПК C12Q1/68 C12N15/00 

Изобретение относится к молекулярной биологии и может быть использовано в судебной медицине, криминалистике, для установления кровного родства в семейном анализе.

Основной способ выявления генетического полиморфизма на уровне строения ДНК стандартный метод блот-гибридизационного анализа. При этом детектируется гомологичные последовательности ДНК разной длины, образующие при гидролизе геномной ДНК рестрикционными эндонуклеазами. Вариации в структуре геномной ДНК обусловлены, главным образом, точковыми мутациями, приводящими к изменению сайтов [1] Наиболее высокоэффективными маркерами полиморфизма являются повторяющиеся минисателлитные ДНК различного типа, в том числе так называемые "простые последовательности".

Известен способ проведения геномной дактилоскопии человеческой ДНК с использованием 32-P-меченого олигонуклеотидного зонда (CAC)₅, представляющего собой повторяющуюся простую последовательность [2] С данным зондом получены наиболее информативные картины блот-гибридизации на ДНК человека, однако широкое внедрение такого зонда в практику затруднено из-за нестабильности радиоактивной метки и опасности работы с ней для персонала лабораторий.

Более перспективным является неизотопный вариант геномной дактилоскопии, в котором используется зонд, меченый нерадиоактивной меткой.

Известен способ проведения гибридизационного анализа эукариотической ДНК, наиболее близкий к заявляемому по техническому решению и достигаемому эффекту (прототип) [3] Известный способ основан на использовании серии олигонуклеотидных зондов, состоящих из повторяющихся простых последовательностей длиной от 2 до 4 оснований, а именно (GATA)₄GA, (GATA)₅, (GATA)₂GACA(GATA)₂, (GATA)₄, (GACA)₄, (GGAT)₄, (GGA)₅, (GT)₈, (CT)₈, а также комплементарных им олигонуклеотидов. В примерах использованы олигонуклеотидные зонды, меченые радиоактивной меткой. Авторы патента предлагают использовать эти же зонды, меченые биотином по 5'-концевому фосфату, при этом они отмечают более низкую чувствительность биотинилированных олигонуклеотидов по сравнению с радиоактивномечеными. Авторы не используют в качестве зонда олигонуклеотид (CAC)₅.

Целью настоящего изобретения является создание нерадиоактивного способа и набора для проведения геномной дактилоскопии эукариотической ДНК, обладающей более высокой чувствительностью и информативностью по сравнению с изотопным методом и позволяющих проводить анализ за более короткое время.

Указанная цель достигается тем, что в предлагаемом способе и в наборе используется нерадиоактивный олигонуклеотидный зонд следующего состава:
3'-CACCACCACCACCAC(C^*T)_nC^*-5',
где n=2-8,
C^* модифицированный дезоксицитидин, содержащий биотин:

При такой конструкции зонд содержит от 2 до 8 остатков биотина, расположенных вне участка гибридизационного взаимодействия и не препятствующих образованию комплекса зонд-ДНК. Кроме того, остатки биотина в зонде пространственно удалены друг от друга за счет наличия Т-спейсеров, что уменьшает стерические препятствия при выявлении биотиновых групп с конъюгатом стрептавидин-фермент.

При проведении поиска не обнаружено технических решений, имеющих признаки, сходные с отличительными признаками заявляемого способа, что позволяет сделать вывод о соответствии его критерию изобретения "существенные отличия".

Сопоставительный анализ заявляемого решения с прототипом показывает, что заявляемый способ отличается от известного тем, что в гибридизационном анализе ДНК используется нерадиоактивный олигонуклеотидный зонд (CAC)₅, содержащий от 2 до 8 остатков биотина, расположенных вне участка гибридизационного взаимодействия, а для выявления биотина после гибридизации используются конъюгат стрептавидина со щелочной фосфатазой и красители. Таким образом, заявляемый способ соответствует критерию изобретения "новизна". Наборы для геномной дактилоскопии такого состава в нашей стране не производятся. За рубежом производство аналогичных наборов ведущими фирмами в области генной инженерии и биотехнологии не выявлено.

При использовании данного способа и набора в анализе человеческой ДНК получены картины блот-гибридизации, более информативные по сравнению с теми, что получены с 32-P-мечеными олигонуклеотидными зондами. Новые признаки технического решения в общей совокупности признаков обеспечивают достижение цели изобретения, следовательно, можно сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию "изобретательский уровень".

Изобретение поясняется чертежом, на котором показана геномная дактилоскопия ДНК человека:
а гибридизация с 32-P-меченым олигонуклеотидом (CAC)₅;
б гибридизация с биотинилированным (CAC)₅; показаны образцы ДНК представителей двух разных семей (в каждой триаде отец, ребенок, мать). ДНК гидролизованы рестриктазой Hinf 1.

Наиболее полно сущность технического решения раскрыта в примерах конкретного изобретения способа и набора.

Пример 1. Синтез биотинилированного (CAC)₅.

Синтез модифицированного основания ведут по описанному методу [4] Синтез олигонуклеотидного зонда осуществляют на колонке с 50 мг пористого стекла CP6-300 (Corning), содержащего 1 мкмоль ковалентно закрепленного диметокситритил-цитозина. Синтез проводят в автоматическом режиме на отечественном синтезаторе "Виктория-5" согласно следующего протокола:
1. Детритилирование 3% трихлоруксусная кислота в дихлорметане, 30 с.

2. Отмывка ацетонитрил, 15 с.

3. Конденсация 0,2 мл 0,1 М фосфамидата диметокситритил-нуклеозида + 0,2 мл 0,5М тетразола в ацетонитриле, 5 мин.

4. Окисление 0,1М I₂ в смеси диоксан-пиридин-вода, 6:3:1, 0,5 мин.

5. Отмывка ацетонитрил, 15 с.

6. Копирование 0,5М уксусный ангидрит в смеси диоксан-лутидин-N-метилимидазол, 6:3:1, 1 мин.

7. Отмывка ацетонитрил, 15 с.

Данный цикл операций повторяют до полного завершения синтеза, носитель обрабатывают 3 мл 25% водного аммиака 12 час при 50^oC, раствор деблокированного олигонуклеотида наносят на колонку 250 х 4 мм с фазой Lichrosorb RP 18 (размер частиц 10 мкм) и элюируют градиентом буферных растворов от 100% В (20% ацетонитрил, 0,1М триэтиламмоний-ацетат, pH 7,0) до 100% А (20% ацетонитрил, 0,1М триэтиламмоний-ацетат) за 30 мин. Синтезированный олигонуклеотид собирают, раствор упаривают досуха, обрабатывают 2 мл 80% уксусной кислоты 1 час при 20^oC, снова упаривают досуха и хранят при -20^oC.

Пример 2. Анализ образцов ДНК.

Гидролиз ДНК рестриктазами, электрофорез фрагментов в агарозном геле и перенос их на фильтры ведут, как описано [5]
1. Предгибридизация.

Фильтр с иммобилизованной ДНК помещают в кювету с гибридизационным раствором и ведут предгибридизацию 30 мин при 40^oC.

Гибридизационный раствор: 6хSSC, 5xДенхардт, 0,5% SDS (20xSSC 3 M NaCl, 0,3 M Na-цитрат pH 7,2; 50хДенхардт 1% поливинилпирролидон, 1% фикол, 1% BSA).

2. Гибридизация.

Фильтр переносят в гибридизационный раствор, содержащий биотинилированный олигонуклеотид (3 мкл олигонуклеотида на 5 мл раствора). На фильтр размером 10х10 см достаточно 5 мл смеси. Ведут гибридизацию в течение 1 часа при 40^oC.

3. Отмывка от зонда.

После гибридизации сливают гибридизационный раствор (его можно использовать повторно), фильтр последовательно промывают 15 мин при комнатной температуре, затем 15 мин при температуре 40^oC в растворе 4хSSC, 0,1% SDS.

4. Блокирование фона.

После гибридизации и отмывки проводят обработку фильтра блокирующим буфером в течение 30 мин при комнатной температуре.

Блокирующий буфер: 0,1М трис-HCl pH7,5,0,1M NaCl, 3 mM MgCl₂, 0,5%-ный твин-20.

5. Обработка конъюгатом.

После стадии блокирования фильтр замачивают на 5 мин в реакционном буфере, затем, промокнув фильтрованной бумагой, переносят его на чистый лист лавсана. Наносят на фильтр конъюгат стрептавидина с фосфатазой, предварительно разбавленный реакционным буфером в 2000 раз (до конечной концентрации конъюгата 0,5-1,0 мкг/мл).

На фильтр размером 10х10 см необходимо 2 мл разбавленного конъюгата. Накрывают фильтр вторым листом лавсана, убирают пузырьки воздуха между листами и оставляют на 30 мин.

Реакционный буфер: 0,1М трис-HCl, pH 7,5, 0,1M NaCl, 3mM MgCl₂, 0,05% твин-20.

6. Отмывка от конъюгата.

Отмывают фильтр от избытка конъюгата 3 раза по 5 мин блокирующим буфером и один раз AP-буфером.

AP-буфер:0,1М трис-HCl, pH 9,5, 0,1M NaCl, 5mM MgCl₂
7. Окрашивание.

Красители для фосфатазы растворяют в диметилформамиде (2,5 мг 5 бром-3-индолилфосфата в 50 мкл ДМФА, 4 мг нитротетразолевого синего в 50 мкл ДМФА) и переносят в пробирку с AP-буфером (15 мл). Фильтр заливают раствором красителей и оставляют в темноте до появления окрашенных полос (обычно 1,5-2 ч при комнатной температуре или 30 мин при 37^oC).

После выявления полос фильтр промывают дистиллированной водой и высушивают.

Пример 3. Состав набора для геномной дактилоскопии.

Набор для геномной дактилоскопии включает в себя следующие компоненты:
биотинилированный олигонуклеотид (CAC)₅ в концентрации 30 опт.ед./мл,
конъюгат стрептавидина со щелочной фосфатазой с концентрацией белка 1,5 мг/мл,
красители для щелочной фосфатазы твердофазный субстрат 5-бром-3-индолилфосфат и нитротетразолевый синий.

Набор рассчитан на проведение 10 опытов блот-гибридизации (анализ около 100 образцов ДНК).

На чертеже видно, что при использовании биотинилированного зонда картина гибридизации более четкая, полосы более дискретны, практически отсутствует фон, характерный для гибридизации с радиоактивным зондом. По результатам гибридизационного анализа ДНК двух смесей можно сделать заключение о том, что в триаде 648-650 нет кровного родства ребенка с предполагаемым отцом, тогда как в триаде 639-641 отцовство несомненно доказано.

Таким образом, предложенные способ и набор для геномной дактилоскопии эукариотической ДНК являются более перспективными для практического применения. Проведение анализа не требует специальных мер безопасности по радиационной защите. Биотинилированный олигонуклеотидный зонд может храниться длительное время не менее года, тогда как радиоактивный зонд нестабилен (период полураспада составляет 14 дней). Значительно сокращается время анализа за счет того, что для выявления биотиновой метки после гибридизации нужно всего 2-3 часа, в то время как радиоавтография фильтра с 32-P-меткой длится несколько суток.

Список литературы.

1. Jeffreys A.J. Wilson V. Thein S.L.// Nature.-1985-V.136.-P.76-79.

2. Schafer R. Zischler H. Epplen J.T.// Nucl.Acids Res.-1988.-V.16,N 11. -P.5196.

3. Epplen J.T. Патент 0266 787 A2 (C 12 Q 1/68) N 871164083 от 11.05.88.

4. Urdea M. S. Warner B.D. Running J.A. Stempien M. Clyne J. Horn T. //Nucl. Acids. Res.-1988.-V.16, N 11.-P.4937-4956.

5. Рысков А.П. Джанчарадзе А.Г. Просняк М.И. и др.// Генетика.-1988.-Т. 24.-С.227-238.

Использование: судебная медицина, криминалистика, научно-исследовательская практика. Сущность изобретения: предварительно расщепленный рестриктазами исследуемый образец ДНК иммобилизуют на фильтре и проводят гибридизацию с биотинилированным олигонуклеотидным зондом формулы 3′-(CAC)₅-(C^*T)_nC^*-5′ , где C^* - биотинилированный дезоксицитидин, а n = 2-8, после чего гибридизационный фильтр обрабатывают конъюгатом стрептавидина со щелочной фосфатазой, отмывают, окрашивают и анализируют полученную картину гибридизации; предложенный набор, состоящий из биотинилированного олигонуклеотидного зонда в концентрации 30 отн. ед./мл, конъюгата стрептавидина со щелочной фосфатазой с концентрацией общего белка 1,5 мг/мл и красителей для щелочной фосфатазы (5-бром-3-индолилфосфата и нитротетразолиевого синего) обеспечивает возможность ускоренного анализа большого числа образцов ДНК. 2 с.п. ф-лы. 1 ил.

1. Способ проведения геномной дактилоскопии, предусматривающий блотгибридизацию ДНК-образца с биотинилированным олигонуклеотидным зондом, содержащим простую повторяющуся последовательность, отличающийся тем, что в качестве олигонуклеотидного зонда используют последовательность
3'-(САС)₅-(С^*Т)_nС^* 5,
где C^* биотинилированный дезоксицитидин;
n 2 8. 2. Набор для проведения геномной дактилоскопии, включающий биотинилированный олигонуклеотидный зонд, содержащий простую повторяющуюся последовательность, конъюгат стрептавидина с щелочной фосфатазой, 5-бром-3-индолилфосфат и нитротетразолиевый синий, отличающийся тем, что зонд представляет собой последовательность
3^'-(CAC)₅-(C^*T)_nC^* 5,
где C^* биотинилированный дезоксицитидин;
n 2 8.