СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ Российский патент 1997 года по МПК G01N33/52 C12Q1/42 

Изобретение относится к области аналитической биохимии, а именно к способам определения липополисахаридов (ЛПС), и может быть использовано во всех видах работ, предусматривающих обнаружение липополисахаридов.

Известно несколько способов количественного определения ОПС. Один из самых распространенных способов основывается на определении в ЛПС уникального и характерного только для них сахара 3-дезокси-Д-манно-октулозоновой кислоты (КДО) [1, 2] Основными этапами этого способа являются:
1. Окисление КДО перйодатом натрия до образования β-формилпировиноградной кислоты.

2. Взаимодействие последней с тиобарбитуровой кислотой с образованием окрашенного в розовый цвет продукта реакции с максимумом поглощения на 548 нм.

3. Определение содержания КДО в образце по калибровочной кривой, построенной для растворов липополисахаридов известной концентрации.

Недостатком этого способа является низкая чувствительность (обнаружение миллиграммовых количеств (мг/мл пробы) липополисахаридов).

Другой способ [3] включает:
1. Фракционирование анализируемого образца липополисахаридов в полиакриламидных гелях, содержащих додецилсульфат натрия.

2. Окрашивание геля раствором нитрата серебра.

3. Сравнение интенсивности окраски ЛПС в образце с интенсивностью окраски стандартных количеств липополисахаридов, нанесенных на соседнюю дорожку геля.

Чувствительность этого способа до 5 нг ЛПС в одной полосе в геле.

Недостатком способа является:
1. Стадия электрофореза в полиакриламидном геле, приводящая к значительному фракционированию липополисахаридов по размеру и, вследствие этого, затрудняющая оценку общего содержания класса этих соединений в анализируемом образце.

2. Труднодоступность гомогенных по размеру стандартов липополисахаридов.

3. Низкая чувствительность способа (для получения достаточно интенсивной окраски полос ЛПС в геле необходимо наносить на гель не менее 100 нг в пробе).

Наиболее чувствительным и обычно используемым способом определения липополисахаридов в плазме и других растворах биологически активных веществ является ЛАЛ-тест [4] основанный на способности белкового лизата циркулирующих амебоцитов краба Lumulus polyphemus сворачиваться (превращаться в гель) при инкубации с липополисахаридами. Чувствительность способа очень высока до 100 нг ЛПС в 1 мл анализируемой пробы и менее.

Способ включает следующие стадии:
1. Подготовка серий стерильных растворов разной концентрации из стандартного стерильного раствора липополисахаридов и серий стерильных разбавлений исследуемого образца.

2. Добавление к каждой смеси раствора Е-ТОХАТЕ (реагента, приготовленного из лизата циркулирующих амебоцитов Limulus polyphemus), и инкубирование при 37^oC в течение 1 ч.

3. Определение содержания ЛПС в исследуемом образце по минимальному количеству образца, приводящему к образованию геля (денатурированные белки реагента Е-ТОХАТЕ).

В модифицированном способе на основе белкового лизата циркулирующих амебоцитов краба Limulus polyphemus Endospecy-тесте [5] в качестве субстрата свертывающего белка используют н-третичный-бутоксикарбонил-L-лейцил-L-глицил-аргинин-п-нитроанилин и освобождающийся в результате реакции п-нитроанилин определяют диазосвязыванием. Измеряют поглощение при l=545 нм. По калибровочной кривой, построенной по стандартному ряду концентраций ЛПС, определяют содержание ЛРС в исследуемом образце.

Несмотря на очень высокую чувствительность ЛАЛ-теста, способ имеет ряд недостатков:
1. Отсутствие отечественного компонента для ЛАЛ-теста лизата циркулирующих амебоцитов краба Limulus polyphemus.

2. Очень высокие требования к стерильности растворов и используемому оборудованию, что не всегда достижимо в биологических лабораториях.

Наиболее близким к заявляемому является иммунно-ферментный способ определения липополисахаридов, иммобилизованных на поливилиден-дифторидных мембранах (6), заключающийся в следующем:
1. Фракционирование образцов ЛПС в 12%-ном полиакриламидном геле, содержащем мочевину.

2. Перенос полос ЛПС из геля на поливинилиден-дифтородную мембрану Immobilon ("Millipore", США) с помощью электроблотинга.

3. Обработка мембраны раствором 10 мМ перйодата натрия в 100 мМ ацетатном буфере, рН 5,5, содержащем 0,2% Твин-20 при комнатной температуре для окисления гидроксильных групп липополисахаридов до альдегидных.

4. Обработка мембраны раствором гидразида дигоксигенин-сукцинил-6-аминокапроновой кислоты ("Boehringer-Mannheim", Германия) в течение 1 ч при комнатной температуре для присоединения дигоксигенина по альдегидным группам липополисахаридов.

5. Обработка мембраны овечьими антителами к дигоксигенину, конъюгированными с щелочной фосфатазой, в буфере, содержащем 20 мМ Трис-НСl, 0,5 М NaCl, 0,5% Твин-20, 0,02% азид натрия, рН 7б8 в течение 1 ч при комнатной температуре.

6. Проявление комплекса с щелочной фосфатазой в присутствии субстрата 5-бром, 4-хлор, индолил-фосфата (BCIP) и нитро-голубого тетразолия (NBT) в качестве хромогена.

Способ-прототип используют для сравнительного изучения молекулярных весов различных ЛПС в бактериальных объектах, при этом на каждой дорожке геля наблюдают около 20 полос ЛПС. Достаточно интенсивная окраска этих полос достигается при нанесении на дорожку геля не менее 70 нг общего количества липополисахаридов, т.е. чувствительность метода около 3 нг ЛПС в одной полосе (≈700 нг/мл пробы при возможности нанесения на дорожку 100 мкл пробы).

Недостатком способа прототипа являются:
1. Фракционирование анализируемых липополисахаридов в полиакриламидном геле затрудняет количественное определение всей группы соединений.

2. Отсутствие отечественного дигоксигенина или его производных, а также отсутствие антител к дигоксигенину.

3. Низкая чувствительность (≈700 нг/мл пробы).

Целью изобретения является упрощение способа определения липополисахаридов и повышение его чувствительности. По чувствительности способ должен приближаться к ЛАЛ-тесту.

Поставленная цель достигается тем, что анализируемые образцы липополисахаридов, предварительно окисленные перйодатом натрия, биотинилируют с помощью гидразида биотина. Модифицированные биотином липополисахариды наносят на нитроцеллюлозные фильтры и проявляют в системе стрептавидин-щелочная фосфатаза, используя в качестве субстрата 5-бром-индолил-фосфат (ВIP) c нитро-голубым тетразолием (NBT) или с хемилюминисцентным субстратом - 3-(2'-спироадамантан)-4-метокси-(3"-фосфорилокси)фенил-1,2-диоксетаном диизопропилэтиламмонийной солью, (ЛЮКС-470).

Хемилюминисцентный субстрат - 3-(2'-спироадамантан)-4-метокси-(3"-фосфорилокси)фенил-1,2-диоксетан диизопропилэтиламмонийная соль, получен по известным методикам [7]
Определение содержания ЛПС в образце проводят визуально, сравнивая интенсивность окраски пятна с интенсивностью пятен стандартных концентраций липополисахаридов, или по калибровочной кривой, построенной для стандартного ряда после замера интенсивности пятен на денситометре ДО-1М.

Анализируемый образец в 100 мМ ацетатном буфере, рН 5,5, 0,2% Твин-20 инкубируют 1 ч при 0^oC cо свежеприготовленным раствором перйодата натрия. Затем добавляют гидразид биотина и продолжают инкубировать 3 ч при 30^oC. Модифицированные ЛПС осаждают 10 объемами этилового спирта.

Осадок отделяют центрифугированием, растворяют в 1 мМ растворе боргидрида натрия и после инкубации в течение 10 мин при комнатной температуре разводят карбонатным буфером, содержащим 10 мМ NaHCO₃, 3 мМ Na₂CO₃, 20% метанола и 0,05% SDS до нужной концентрации.

На нитроцеллюлозный фильтр с размером пор 0,20-0,22 мкм наносят аликвоты объемом 1 мкл. Фильтр обрабатывают конъюгатом стрептавидин-щелочная фосфатаза и полученные комплексы проявляют либо с субстратом бром-индолил фосфатом и хромогеном нитроголубым тетразолием, либо с хемилюминисцентным субстратом ЛЮКС-470.

После проявления комплексов ВIP и NBT в местах нанесения липополисахаридов наблюдаются пятна фиолетового цвета, интенсивность которых пропорциональна количеству нанесенных ЛПС.

В случае субстрата ЛЮКС-470 после обработки им фильтра на последний накладывают рентгеновскую пленку РМ-В, инкубируют при 37^oC в течение суток, затем пленку проявляют. На проявленной пленке наблюдают темные пятна, интенсивность которых пропорциональна количеству нанесенных на фильтр липополисахаридов.

Чувствительность метода до 1 пг ЛПС в пятне (1 мкл) с субстратами ВIP и NBT и 0,1 пг с ЛЮКСом-470 (1 нг/мл и 0,1 нг/мл пробы соответственно).

Определяющими отличительными признаками предлагаемого способа являются следующие:
проведение реакции перйодатного окисления и биотинилирования ЛПС не на фильтрах, а непосредственно в анализируемой пробе последовательно, в оптимальных экспериментально подобранных условиях,
нанесение биотинилированных липополисахаридов на нитроцеллюлозный фильтр и проявление в системе конъюгата стретавидин-щелочная фосфатаза,
использование для проявления конъюгата стрептавидин-щелочная фосфатаза хемилюминисцентного субстрата.

Предлагаемый способ позволяет:
повысить чувствительность определения ЛПС до 1 пг в пробе (1 нг/мл), что в 70 раз выше по сравнению со способом-прототипом; в случае использования в качестве хромофора ЛЮКС-470 повысить чувствительность в 700 раз (0,1 пг в пробе, 0,1 нг/мл);
избежать применения труднодоступного дигоксигенина и антител к нему, использовать широко распространенную систему биотин-стрептавидин;
исключить стадию фракционирования ЛПС в полиакриламидном геле и сделать метод количественным, сравнивая интенсивность окраски анализируемой пробы с калибровочным рядом.

Выбор условий реакций перйодатного окисления и биотинилирования определяется растворимостью биотина в буферных растворах с различными рН и зависимостью эффективности реакций от температуры и времени проведения реакции. Мы провели сравнение эффективности модификации ЛПС при двух значениях рН, при различной температуре и времени проведения реакций.

Обнаружено, что в нашем случае обе реакции лучше проходят при рН 5,5 (трис-ацетатный буфер), чем при рН 6,8 (трис-НСl буфер) фиг.3. Лучшими условиями для перйодатного окисления являются 0-2^oC 1 ч (несколько хуже 20 мин, температура комнатная), а для биотинилирования (30±2)^oC 3 ч (несколько хуже при 37^oC 30-60 мин), фиг.4.

Поскольку вышеуказанные существенные отличительные признаки заявляемого способа в известных научно-технических источниках заявителем не обнаружены, то можно сделать вывод, что предлагаемое техническое решение соответствует критерию "изобретательский уровень".

На фиг.1. Определение липополисахаридов в препаратах липополисахаридов, выделенных из Е. соli в НИКТИ БАВ (1), и фирмы "Сигма" США (2) с использованием хромогенного субстрата ВIP и NBT.

Условия проведения перйодатного окисления: 100 мМ ацетат натрия, рН 5,5, 0,2% Твин-20, 5 мМ перйодат натрия 0^oC, 1 ч.

Условия биотинилирования буфер тот же, 5 мМ гидразид биотина - 30^oC, 3 ч.

Проявление биотинилированных ЛПС проводят конъюгатом стрептавидин-щелочная фосфатаза, используя в качестве субстрата броминдолил фосфат и хромогена нитро-голубой тетразолий.

На фиг. 2. Определение липополисахаридов с помощью хемилюминисцентного субстрата ЛЮКС-470.

Условия проведения реакции как на фиг.1. Проявление биотинилированных ЛПС проводили с использованием хемилюминисцентного субстрата - 3-(2'-спироадамантан)-4-метокси-(3"-фосфорилокси)фенил-1,2-диоксетана диизопропилэтиламмонийной соли (ЛЮКС-470).

На фиг.3. Определение липополисахаридов после модификации в 100 мМ ацетате натрия, рН 5,5 (1) и в 50 мМ Трис-НСl, pH 6,8 (2). Проявление биотинилированных липополисахаридов проводили с ВIP и NBT.

На фиг. 4. Влияние температуры и времени реакций перйодатного окисления (а) и биотинилирования (б) на эффективность модификации ЛПС.

Обе реакции проводили в ацетатном буфере, рН 5,5, комплексы ЛПС с щелочной фосфатазой проявляли с ВIP и NBT.

Приведенные ниже конкретные примеры подробно раскрывают сущность изобретения.

Пример 1. Определение липополисахаридов с использованием хромогенного субстрата ВIP и NBT.

Навески образцов липополисахаридов 200 мкг растворяют в 20 мкл 1%-ного раствора SDS (до конечной концентрации ЛПС 10 мг/мл). Отбирают аликвоту 1 мкл и помещают в пробирку, содержащую 25 мкл 100 мМ ацетата натрия, рН 5,5, 0,2% Твин-20. Добавляют 5 мкл свежеприготовленного 30 мМ раствора перйодата натрия (до конечной концентрации 5 мМ). Реакцию окисления ведут в ледяной бане (при температуре 0^oC в течение 1 ч).

Затем в пробирку добавляют 7,5 мкл 25 мМ (6,4 мг/мл) раствора гидразида биотина в 30%-ном диметилформамиде. Реакцию биотинилирования ведут 3 ч при 30^oC и биотинилированные липополисахариды осаждают 10 объемами этанола.

Осадок собирают центрифугированием, растворяют в 10 мкл 1 мМ боргидрида натрия и инкубируют 10 мин при комнатной температуре. Затем делают серию разбавленной биотинилированных ЛПС в буфере, содержащем 10 мМ NaHCO₃, 3 мМ Na₂CO₃, 20% метанол, 0,5% SDS, и наносят на сухой нитроцеллюлозный фильтр следующие количества ЛПС в объеме 1 мкл:
100 нг, 10 нг, 1 нг, 100 пг, 10 пг, 1 пг, 0,1 пг.

Фильтр высушивают на воздухе, затем промывают 5 мин в буфере PBS (150 мМ NaCl, 50 мМ KH₂PO₄, pH 6,5) и инкубируют 30 мин в блокирующем буфере (0,1 М трис-НСl, pH 7,5, 0,1 М NaCl, 3 мМ MgCl₂, 0,5% Твин-20). Далее фильтр промывают трижды по 5 мин реакционным буфером (0,1 трис-НСl, рН 7,5, 0,1 М NaCl, 3 мМ MgCl₂, 0,05% Твин-20) и обрабатывают конъюгатом стрептавидинщелочная фосфатаза с концентрацией 350 ед/мг в 1 мл, разбавленным в 1000 раз, в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем фильтр промывают трижды по 5 мин блокирующим буфером и один раз буфером для щелочной фосфатазы (0,1 М Трис-НСl, рН 9,5, 0,1 М NaCl 5 мМ MgCl₂). Проявляют комплексы ЛПС со щелочной фосфатазой инкубацией фильтра в растворе бром-индолил фосфата (2,5 мг на 15 мл раствора) и нитро-голубого тетразолия (2,5 мг на 15 мл раствора) в буфере для щелочной фосфатазы. Результаты представлены на фиг.1. Видно, что с данными субстратами можно обнаружить до 1 пг ЛПС.

Пример 2. Определение липополисахаридов с помощью хемилюминесцентного субстрата 3-(2'-спироадамантан)-4-метокси-(3"-фосфорилокси)-фенил-1,2-диоксетата диизопропилэтиламмонийной соли.

Проведение анализа аналогично примеру 1, за исключением того, что проявление комплексов ЛПС со щелочной фосфатазой проводили инкубацией нитроцеллюлозного фильтра в растворе ЛЮКС-470 (30 мин при комнатной температуре) с последующей радиоавтографией на рентгеновскую пленку при 37^oC в течение ночи. На фиг.2 представлена радиоавтограмма обработанных таким образом липополисахаридов. Видно, что с ЛЮКСом-470 обнаруживается до 0,1 пг ЛПС.

Пример 3. Влияние рН на эффективность биотинилирования липополисахаридов.

Проведение анализа аналогично примеру 1, за исключением того, что реакция перйодатного окисления и биотинилирования проводили при рН 6,8 (50 мМ трис-НСl). На фиг.3 представлены результаты этого эксперимента. Для сравнения представлен ряд стандартных концентраций лиополисахаридов, модифицированных в трис-ацетатном буфере рН 5,5. Видно, что эффективность модификации ЛПС при рН 5,5 на 3 порядка выше, чем при рН 6,8.

Пример 4. Влияние температуры и времени реакции на эффективность биотинилирования ЛПС.

Проведение анализа аналогично примеру 1, за исключением того, что варьировали температуру и время реакции перйодатного окисления (а) или биотинилирования (б). На фиг.4 представлены результаты этих экспериментов. Наилучшие результаты наблюдаются при окислении перйодатом при 0^oC в течение 1 ч и биотинилировании при 30^oC в течение 3 ч.

Использование предлагаемого способа позволяет по сравнению с прототипом:
упростить способ за счет устранения фракционирования липополисахаридов гель-электрофорезом, последовательного проведения реакций перйодатного окисления и биотинилирования в одном и том же растворе и нанесения на нитроцеллюлозный фильтр уже модифицированных ЛПС;
избежать применения труднодоступного дигоксигенина и овечьих антител к дигоксигенину;
повысить чувствительность метода в 70 раз, а за счет применения хемилюминисцентного субстрата ЛЮКС-470 в 700 раз.

Литература
1. Hendler R.W. Burgess A.H. Anal. Biochem. 1972, v.47, n.1, p. 109-122.

2. Karkhanis Y. D. Zeltner J.Y. Jackson J.J. Carlo D.J. Anal. Biochem. 1978, v/85, n.2, p.595-601.

3. Tsai Ch.-M. Frasch C.E. Immmunopharmacology of bacterial endotoxins, Eds. Szentimnyi A. Fridman H./ Plenum, 1986, p.89-96.

4. Sigma Technical Bulletin N 210 k E-TOXATE Catalog N 210-2.

5. Stein M. A. Mc Allister, Johnston K.H. Diedrith D.L. Anal. Biochem. 19980, v.188, n.2, p.285-287.

6. Mifflin Th.E. Bwden J. Lowell M.A. Bruns D.E. Hayden F.G. Groschel D. H.M. Savory J. Clin. Biochem. 1987, v.20, p.231-235.

7. Методы эксперимента в органической химии, изд. "Химия", М, 1968, 206 л.

Использование: аналитическая биохимия, биотехнология. Сущность изобретения: липополисахариды (ЛПС) определяют путем их окисления перйодатом с последующим биотинилированием, иммобилизацией модифицированных ЛПС на нитроцеллюлозной мембране и проявлением конъюгатом стрептавидин - щелочная фосфатаза в присутствии субстратов. Метод позволяет обнаруживать ЛПС в концентрации 1 нг/мл при использовании в качестве субстрата 5-броминдолил фосфата и нитро-голубого тетразолия в качестве хромогена и 0,1 нг/мл при использовании в качестве субстрата 3-(2-спироадамантан-4-метокси-(3"-фосфорилокси)-фенил-1,2- диоксетандиизопропил-этиламмонийной соли. 4 ил.

1 Способ определения липополисахаридов (ЛПС), включающий иммобилизацию ЛПС на мембране, окисление перйодатом, модификацию по альдегидным группам, обработку модифицированных ЛПС конъюгатом щелочной фосфатазы до образования комплекса "ЛПС конъюгат щелочной фосфатазы" и выявление его с помощью проявляющего агента, отличающийся тем, что ЛПС окисляют и модифицируют до стадии иммобилизации, при этом окисление проводят при 0 25<198>С в течение 20 60 мин, модификацию осуществляют гидразинбиотином при 30 37<198>С в течение 1 3 ч, модифицированные ЛПС иммобилизуют на нитроцеллюлозной мембране, в качестве конъюгата используют стрептавидин-щелочную фосфатазу, в качестве проявляющих агентов используют хромогенный субстрат бром-индолилфосфат (BIP) с нитроголубым тетразолием (NBT) с последующей денситометрией или хемилюминесцентный субстрат 3-(2- спироадамантан)-4-метокси-(3'-фосфорилокси)- фенил-1,2-диоксетандиизопропилэтиламмонийная соль (ЛЮКС-470) с последующей радиоавтографией.