СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ И КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭКДИСТЕРОИДОВ В РАСТИТЕЛЬНЫХ ОБЪЕКТАХ Российский патент 1997 года по МПК G01N33/50 G01N30/02 G01N30/90 

Изобретение относится к биоорганической химии и химии природных и физиологически активных веществ и может быть использовано при поиске новых перспективных источников экдистероидов среди объектов растительного мира для получения необходимых количеств чистых гормонов при исследовании в различных областях медицины.

Известен способ количественного определения экдистероидов с применением реакции Чугаева [1] Недостатком способа является то, что после хроматографического разделения на стеклянных пластинках с нанесенным силикагелем ЛС 5/40 необходимо проведение реакции элюированных экдистероидов с хлористым цинком в "ледяной" уксусной кислоте с добавлением ацетилхлорида, с последующим нагреванием и спектрофотометрированием.

Наиболее близким к предполагаемому изобретению по технической сущности и достигаемому результату является хроматоспектрофотометрический способ определения экдистерона в сухом растительном сырье (листья, стебли, корни) [2] в котором разделение спиртовых экстрактов осуществляется на стеклянных пластинах с закрепленным слоем алусила в системе растворителей хлороформ-метанол-ацетон в соотношении 6:2:1 с последующим спектрофотометрированием элюатов, содержащих экдистероиды.

Недостатками этого способа являются: трудоемкость сбора, сушки, подготовки сырья к анализу; необходимость приготовления стеклянных пластинок и трудности воспроизведения однородности слоя, что сказывается на результатах анализа; выявление этанола раствором ванилина в серной кислоте; большой расход растворителей при хроматографировании и элюировании.

В основу настоящего изобретения поставлена задача сокращения времени качественного обнаружения и количественного определения экдистероидов.

Поставленная задача решается тем, что в предлагаемом способе обнаружения и количественного определения экдистероидов в растительных объектах путем хроматографического анализа в качестве исходного сырья используют семена цветковых растений, а хроматографический анализ осуществляют одним из методов: тонкослойной хроматографии (ТСХ), газожидкостной хроматографии (ГЖХ), высокоэффективной хроматографии (ВЭЖХ).

Причем, применяя метод ТСХ, экстракт анализируют на стандартных пластинах Силуфол УФ-254 в системе растворителей хлороформэтанол (3:1) и детектируют экдистероиды в УФ-свете; применяя метод ВЭЖХ, экстракт анализируют с использованием октадецилпривитых силикагелей (С-18) в качестве насадок разделительных колонок в водно-этанольных элюирующих системах, а детектирование осуществляют УФ-детектором при 254 нм; ГЖХ предполагает анализ экстракта на кварцевых капиллярных колонках с силиконовой фазой типа OV-101, а детектирование осуществляют электронно-захватным детектором.

Введение вышеуказанных отличительных признаков позволяет получить технический результат, который невозможно достичь в прототипе.

Известно, что многолетние растения в первый год жизни синтезируют малое количество экдистероидов, иногда меньше предела обнаружения инструментальных методов, а максимальное накопление наблюдается на 2-3 году [3] Кроме того, большую долю в пробу надземной части вносят стебли и листья, отличающиеся, как правило, малым содержанием исследуемых соединений. Наибольшее накопление их свойственно репродуктивным органам (бутонам, цветам и семенам) [3, 4] но вклад их в общую массу растений очень мал. Так на первом году жизни содержание экдистерона в надземной части лихниса халкедонского составляет 0,15, на втором и третьем 0,41 и 0,36% соответственно, тогда как в семенах второго года 0,76% Качественное обнаружение и количественное определение экдистероидов в предлагаемом способе проводится любым хроматографическим методом: ТСХ, ВЭЖХ или ГЖХ. В предлагаемом способе разделение экстрактов при ТСХ определении осуществляется на стандартных пластинках Силуфол УФ-254 с тонким слоем сорбента, что значительно улучшает воспроизводимость результатов и сокращает время анализа. Наличие же люминесцентного индикатора на этих пластинках упрощает детектирование экдистероидов, исключая применения реактива обнаружения. А поскольку слой сорбента на стандартных пластинках значительно тоньше, чем на препаративных, то расход растворителей меньше, кроме того, спиртовые экстракты семян не требуют дополнительной очистки органическими растворителями и добавки к силикагелю окиси алюминия, как в прототипе, вследствие малого содержания пигментов и других сопутствующих веществ.

Технический результат, который достигается применением заявляемого решения, выражается в сокращении времени качественного и количественного определения экдистероидов в растительных объектах с одновременным улучшением точности и воспроизводимости результатов анализа. Это в конечном итоге, обеспечит прогресс в поиске перспективных источников экдистероидов среди объектов растительного мира, что особенно актуально, учитывая широкий спектр фармакологического действия этих стероидов.

Пример 1. 0,2-0,1 г семян рода Смолевка (Silene) экстрагируют 70% этанолом дважды, концентрируют. Экстракт наносят на активированную пластинку Силуфол и хроматографируют в системе растворителей хлороформ-этанол (3:1). Для качественного обнаружения экдистероиды детектируют в УФ-свете. Для количественного определения обозначенную в УФ-свете зону пятен на уровне эталонов экдистероидов снимают и элюируют 96% этанолом в течение 4-х часов. Затем элюат фильтруют и спектрофотометрируют при 242 нм. Время подготовки сырья, подготовки к анализу, анализа и расход растворителей приведены в таблице 1. Результаты определения экдистероидов сведены в таблицу 2.

Пример 2. Экстракты семян рода Смолевка приготовляют, как описано в примере 1, а определение экдистероидов ведут методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на приборе "Милихром" с использованием колонки с октадецилпривитым силикагелем (C-18) Лихросорб RP-18 в системе метанол-вода (8: 2). Детектирование осуществляют УФ-детектором при длине волны 254 нм. Качественное определение экдистероидов проводят по временам удерживания этанолов в идентичных условиях, а количественное по предварительно полученным на эталонах калибровочным зависимостям. Результаты приведены в таблицах 1, 2.

Пример 3. Экстракты семян готовят, как описано в примере 1, затем добавляют N-(триметилсилил)имидазол в количестве 1 мл на 10 мл экстракта и встряхивают в течение 30-45 минут. Анализ экдистероидов в виде триметилсилильных эфиров осуществляют методом газо-жидкостной хроматографии на приборе модель "3700" на кварцевой капиллярной колонке (25 м x 0,22 мм) с силиконовой иммобилизованной фазой OV-101 (толщина слоя 0,1 мкм) и электронно-захватным детектором. Условия разделения: газ-носитель азот (в.ч.) 0,8-1,0 см³/мин, температура колонки 270-310^oC. Качественный анализ проводят по временам удерживания ТМС-эфиров экдистероидов-эталонов, количественный по предварительно полученным калибровочным зависимостям в идентичных условиях анализа.

Результаты приведены в таблицах 1 и 2.

Как видно из данных, приведенных в таблице 1, использование предлагаемого способа по примерам 1-3 позволяет существенно ускорить проведение всех стадий подготовки и анализа экстрактов и заметно снизить расход используемых растворителей.

Как видно из данных, приведенных в таблице 2, использование предлагаемого способа позволяет не только быстрее обнаружить, но и определить экдистероиды количественно с большей точностью, чем у прототипа.

Таким образом, использование предложенного способа позволяет сделать заключение о присутствии экдистероидов в целых растениях в любую фазу развития на основании предварительного обнаружения и количественного определения в семенах. Применение этого способа к поиску экдистероидов в растительных объектах ускоряет химический скрининг, повышает вероятность обнаружения, упрощает способ определения, повышает точность и воспроизводимость количественного определения. За 15-20 лет активного изучения фитоэкдистероидов исследователями было обнаружено их присутствие в 18 видах рода Silene а использование же предлагаемого решения позволило за 1 год проанализировать 60 видов и выявить 20 новых продуцентов экдистероидов из указанного рода.

Техническая осуществимость предлагаемого изобретения очевидна, поскольку используется серийно выпускаемая отечественная аппаратура, товарно-производимые пластины и органические растворители.

Источники информации
1. Холодова Ю. Д. Применение реакции Чугаева для количественного определения экдизонов //Химия природ. соедин. 1977. с. 227-230.

2. Хроматоспектрофотометрический метод определения экдистерона в растительном сырье /М.Р. Якубова, Г.Л. Генкина, Т.Т. Шакиров, Н.К. Абубакиров //Химия природ. соедин. 1978. с. 737-740 (прототип).

3. Зибарева Л. Н. Фитоэкдистероиды и другие химические компоненты растений рода Lychnis: Автореф. дис. канд. хим. наук. Новосибирск, 1991. 19 с.

4. Вересковский В. В. Чекалинская И.И. Пашина Г.В. Динамика содержания экдистерона у видов рода Rhaponticum Ludw. //Растительн. ресурсы. 1983. - Вып.1 с. 60-65.

Использование: изобретение относится к биоорганической химии и химии природных и физиологически активных веществ и может быть использовано при поиске новых перспективных источников экдистероидов среди объектов растительного мира для получения необходимых количеств чистых гормонов при исследованиях в различных областях медицины. Сущность изобретения: предложенный способ позволяет сделать заключение о присутствии экдистероидов в целых растениях на основании предварительного обнаружения в семенах путем тонкослойной, высокоэффективной жидкостной или газожидкостной хроматографии. 2 табл.

Способ обнаружения и количественного определения экдистероидов в растительных объектах путем хроматографического анализа исходного сырья, отличающийся тем, что в качестве исходного сырья используют семена цветковых растений, а анализ осуществляют путем тонкослойной высокоэффективной жидкостной или газожидкостной хроматографии.