СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕАГЕНТА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПЕРВОГО КОМПОНЕНТА КОМПЛЕМЕНТА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ Российский патент 1997 года по МПК A61K35/14 A61K35/16 

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, в частности к функциональной диагностике.

Из известных наиболее близким способом является S.H. Neoh, T.P. Gordon and P. J. Roberts-Thomson "A Simple One-Step Procedure for Preparation of Cl-Deficient Human Serum", Journal of Immumological Methods, v. 69, p 277-280, 1984. В данном способе реагент на первый компонент комплемента (PI) приготовляется из сыворотки крови человека путем осаждения из нее первого компонента комплемента (CI) полиэтиленгликолем с молекулярным весом 6 кД в конечной концентрации 3,85% pH среды поддерживается на уровне 7,7, тестирование первого компонента проводится общепринятым многоприборочным статическим методом.

Наиболее существенным недостатком известного способа является то, что при тестировании получаемого реагента методом кинетического титрования (авт. св. N 1649434 A1 от 5.08.88, Шкуров В.И. Емец В.И. Рачинский А.З. и др. "Способ определения гемолитической активности третьего компонента комплемента человека") постоянно обнаруживалась остаточная активность CI, достигавшая 20-40% и выше от первоначальной активности комплемента сыворотки, взятой для приготовления PI (табл. 1).

Результаты кинетического титрования трех образцов PI, приготовленных по способу-прототипу, показаны в табл. 1.

Целью изобретения является повышение специфичности за счет получения реагента, полностью лишенного активности CI. При его смешивании с эритроцитами, сенсибилизированными гемолизинами, реакция разрушения клеток не должна возникать. Однако при добавлении к такой смеси нативной тестируемой сыворотки, содержащей некоторое количество CI, комплементарный лизис должен происходить, причем со скоростью, пропорциональной содержанию в тестируемой сыворотке первого компонента.

Цель достигается тем, что после первичного осаждения первого компонента полиэтиленгликолем молекулярной массой 6 кД в конечной концентрации 4,1-4,3% и удаления осадка центрифугированием, надосадочную жидкость, содержащую остаточную активность CI, разбавляют вдвое 4,1-4,3% полиэтиленгликолем того же молекулярного веса. Далее смесь подкисляют до pH 5,5. Небольшой осадок, который возникает при этом, содержит всю остаточную активность первого компонента и удаляется дополнительным центрифугированием при 5000 об/мин. Просветленный супернатант подщелачивается до pH 6,5 и хранится в замороженном до 50 состояния. Специфичность предлагаемого реагента доказывается экспериментом с восстановлением комплементарной активности после добавления к нему осадка, полученного при обработке сыворотки по способу-прототипу, при котором происходит почти полное восстановление первоначальной активности сыворотки.

Пример конкретного осуществления способа. Для проверки надежности работы реагента была проведена его раститровка с несколькими сыворотками и определены погрешности измерения активности CI.

Активность рассчитывали по формуле:

где Q количество взятой для анализа исходной сыворотки, мкл;
B постоянный коэффициент при определении первого компонента комплемента, равный 0,34;
t время 50% лизиса по кривой светопропускания, мин;
A активность первого компонента в единицах кинетического титрования, CHк/мл.

Результаты проверки кинетического титрования образцов сыворотки с приготовлениями по предлагаемому способу PI приведены в табл.2.

Способ получения реагента для определения гемолитической активности первого компонента комплемента в сыворотке крови человека и животных. Цель изобретения - повышение специфичности за счет получения реагента полностью лишенного активности первого компонента системы комплемента, при смешивании которого с эритроцитами, сенсибилизированными гемолизинами, реакции разрушения клеток не возникает. Однако при добавлении к смеси нативной сыворотки человека и животных, содержащей некоторое количество CI комплементарный лизис происходит и скорость его пропорциональна содержанию в тестируемой сыворотке первого компонента комплемента. В качестве реагента используется сыворотка крови, из которой удаляется первый компонент комплемента путем добавления к ней полиэтиленгликоля массой 6 кД в концентрации 4,1-4,3%, и после удаления осадка супернатант разбавляется вдвое 4,1-4,3%-ным водным раствором полиэтиленгликоля той же массы и подкисляется до pH 5,5. При этом в осадок переходит вся остаточная активность CI. После удаления осадка центрифугированием при 5000 об/мин полученный реагент подщелачивается до pH 6,5. 2 табл.

Способ получения реагента для определения гемолитической активности первого компонента комплемента в сыворотке крови человека и животных путем осаждения этого компонента раствором полиэтиленгликоля, отличающийся тем, что осаждение осуществляют полиэтиленгликолем концентрацией 4,1 4,3% полученный раствор разбавляют полиэтиленгликолем той же концентрации в соотношении 1:1, среды подкисляют до рН 5,5, отделяют от осадка центрифугированием при 5000 об/мин, после чего реагент доводят до рН 6,5.