Способ определения гемолитической активности третьего компонента комплемента сыворотки крови человека Советский патент 1991 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, к способам функциональной диагностики.

Целью изобретения является сокращение числа операций и повышение точности.

Способ количественного определения гемолитической активности третьего компонента комплемента в сыворотке крови человека осуществляют следующим образом.

Готовят реагент-сыворотку крови человека дефицитную по третьему компоненту комппемента путем инкубации свежей сыворо ки (или плазмы) с равным объемом насыщенного раствора бромистого калия в течение 48 ч. Далее бромистый калий удаляют диализом против веронал-мединалового буфера. Реагент сохраняет свою активность в течение двух недель при +4 °С или в течение нескольких месяцев при -70°С.

Для проведения анализа готовят взвесь эритроцитов со светопропуска- нием 0,5 (0,49-0,51) на светофильтре V 4 фотоэлектроколориметра против физического раствора. Вносят по 5 мл этой взвеси в кюветы с толщиной све- топропускания 10 мм. Кюветы помещают в термостатированные ячейки, смонтированные на фотоэлектроколориметре, которые позволяют поддерживать температуру в кюветах 37°С. На крышке фотоэлектроколориметра смонтированы , пластмассовые мешалки, перемешивающие взвесь эритроцитов во время реакции. В каждую кювету добавляют по 0,05 мл кроличьей гемолитической сыворотки в разведений 1:2 и эритроциты оставля- JQ ют на сенсибилизацию на 10 мин (только первую пробу). Правая кювета служит контролем. В левую кювету вносят 100-400 мкл испытуемой сыворотки в разведении 1:100 или 200-400 мкл в 15 разведении 1i40 вместе с 600 мкл реагента . Одновременно с внесением сыворотки включают запись гемолиза эритроцитов во времени на самописце, подключенном к .фотоэлектроколориметру. При следующем анализе правую кювету переносят в левую ячейку, а в левую кювету заливают новую порцию эритроцитов (5 мл) и 0,05 мл гемолитической сыворотки и помещают ее в правую ячейку фотоэлектроколориметра. Во - время гемолиза, происходящего в левой кювете, в правой кювете, служащей контролем, происходит сенсибилизация эритроцитов для следующего титрования ..Q Кинетограммы представляют собой типичные S-образные кривые. Расчет активности третьего компонента комплемента проводят по формуле

20

25

А

10000

где

t k

А Q - количество взятой для анализа исходной сыворотки, мкл, время 50%-ного лизиса, мин, коэффициент, постоянный при определении активности данного компонента, равный для СЗ - 0,57,

активность третьего компонента комплемента, находящегося в 1 мл испытуемой сыворотки, способствующего гемолизу 5 мл взвеси эритроцитов барана со светопропусканием 0,5 за 1 мин.

Время 50%-ного лизиса находят, опустив перпендикуляр из точки деления ординаты кинематограммы пополам на ось абсцисс диаграммной ленты самописца. Линейность отношений, выражаемая используемой формулой, имеет место при достаточных разведениях испытуемой сыворотки. Третий компонент

1649434 4

комплемента сыворотки человека наиболее точно титруется при разведении сыворотки 1:100.Разведение 1:40 используется для сывороток с активностью третьего компонента значительно ниже физиологической нормы. Для определения активности третьего компонента комплемента кинетическим методом практически достаточно получить кине- тограмму для одной дозы (Q), если она достаточна для осуществления 100%-но- го лизиса эритроцитов, содержащихся в кювете. При этом затрачиваются ничтожные количества сыворотки (1-10 мкл). Ошибка измерения при этом не превышает i5%. Использование дозы меньше 1 мкл приводит к затратам более 10 мин, при этом не выдерживается линейность при использовании данной f формулы расчета, так как не достигается 100%-ный лизис эритроцитов. Использование дозы более 4 мкл (до 10 мкл) возможно при низкой активности третьего компонента, но разведение сыворотки должно быть при этом 1:40, так как при разведении 1:100 получаются большие объемы, что ведет к нарушению физических параметров проведения реакции.

Для повышения точности определения выбрана доза реагента 600 мкл, чтобы избежать попадания на сгиб кривой при приготовлении очередного реагента, а большую дозу не использовали из-за ограниченного объема кювет фотоэлектроколориметра (примерно 7 мл) и из экономических соображений.

В таблице приведен сравнительный анализ осуществления предлагаемого способа и способа-прототипа.

По сравнению с базовым объектом предлагаемый способ значительно проще, так как не требует применения чистых С1 и С4, и быстрее, так как- используется 1 разведение испытуемой сыворотки, а не серийные разведения, требующие измерения каждой пробы из этой серии на ФЭКе. Кроме того, для быстроты расчетов для самописца с определенной скоростью движения ленты на ЭВМ можно рассчитать активность СЗ для ряда доз испытуемой сыворотки и различного времени гемолиза, используя предлагаемую формулу расчета. Тогда для получения результата необходимо только измерить расстояние от стартовой линии (начало реакции) до точки 50%-ного гемолиза на кривой ли35

40

45

50

55

зиса к по таблице найти активность СЗ.

Формула изобретения Способ определения гемолитической активности третьего компонента комплемента сыворотки крови человека путем ее разведения с последующим смешиванием с реагентом дефицитным по третьему компоненту комплемента и сенсибилизированными эритроцитами барана, регистрации степени гемолиза в пробе и расчета активности, о т л и

чающийся тем, что, с целью сокращения числа стадий и повышения - точности, сыворотку смешивают с реагентом в соотношении (1-10):600, а сенсибилизированные эритроциты нс- пользуют без комплекса с , регистрацию степени гемолиза осуществляют по оптической плотности на кинетической кривой и по 50% величине гемолиза рассчитывают активность Cj компонента комплемента.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, s частности к функциональной диагностике. Цель изобретения - сокращение числа операций и повышение точности способа определения гемолитической активности третьего компонента комплемента. Под действием третьего компонента комплемента испытуемой сыворотки,смешанной с реагентом, в качестве которого применяется донорская сыворотка с инактивированным третьим компонентом комплемента, в термостатированных кюветах при 37 С происходит гемолиз сенсибилизированных эритроцитов барана, который записывается во времени на самописке. Способ может использоваться з качестве диагностического теста при оценке состояния гуморального иммунитета при трансплантации органов и тканей, в диагностике ауто- имунных и онкологических заболеваний, 1 табл.

Сравниваемые приз- Предлагаемый

1

наки

Остаточная активность РЗ, приготовленному пс прототипу

Остаточная активность РЗ, приготовленному по предлагаемому способу

Использование чис- Исключается тьк С1 и С4 компонентов

Количество испытуемой сыворотки

Время инкубации

Измерение гемолиза

Активность СЗ

I Способ-прото- I тип

Не определяется

Не определяет- Не определя- сяется

Необходимо

1-4 мкл}1 раз- Серияразвеведениедений(10-20)

по 50мкл

1 проба - 10 мин 1 ч

Измерение ге- молиза на ФЭКе серии проб с разными разведениями сыворотки (примерно 1 ч)

Выражается как величина, обратная разведению образца, при котором наступает 50%-ный гемолиз