ШТАММ БАКТЕРИЙ LACTOCOCCUS LACTIS SUBSPECIES LACTIS ВКПМ В-8558, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В ПРОИЗВОДСТВЕ МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТАРТЕРНОЙ КУЛЬТУРЫ ШТАММА LACTOCOCCUS LACTIS SUBSPECIES LACTIS ВКПМ В-8558 Российский патент 2007 года по МПК C12N1/20 A23C9/123 C12P19/04 C12R1/46 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, молочной промышленности и может быть использовано в производстве молочных продуктов с высокими реологическими и качественными показателями.

Молочные продукты играют важную роль в рационе питания различных групп населения. Выпускаемые отечественными производителями молочные продукты отвечают установленным требованиям в нашей стране, тем не менее на предприятиях сталкиваются с определенными трудностями при получении продуктов со стабильными показателями качества и безопасности.

Для улучшения реологических характеристик и увеличения срока годности продуктов в пищевой промышленности используются полисахариды растительного (натуральные и модифицированные) и микробиологического происхождения в виде пищевых добавок, требующих специального разрешения по их применению. Иногда только применение композиции полисахаридов позволяет получить положительный результат. Таким образом, производители сталкиваются со множеством проблем и задач перед выбором пищевой добавки, применение которой должно подразумевать протекание минимальных изменений в технологической цепочке [1].

В настоящее время в России приняты новые ГОСТы, касающиеся производства национальных продуктов, в которых не допускается применять пищевые добавки. Альтернативой данным пищевым добавкам и перспективным направлением является применение натуральных биологически полезных веществ с функциональными свойствами, которые одновременно способствовали бы получению продуктов с требуемыми свойствами, стабильными в процессе хранения. Одним из факторов, влияющих на ход процесса биотрансформации исходного сырья при получении ферментированных молочных продуктов, являются стартовые культуры. За рубежом в последние годы ведутся исследования по применению в производстве молочных продуктов молочнокислых бактерий, синтезирующих экзополисахариды (ЭПС), главным преимуществом которых является использование in situ (т.е. на месте), что в огромной степени упрощает задачи производителей [2]. В нашей же стране только недавно появились первые публикации о бифидобактериях, продуцирующих ЭПС [3]. Итак, многие из перечисленных выше трудностей по применению полисахаридов-стабилизаторов могут быть разрешимыми с использованием молочнокислых бактерий, продуцирующих ЭПС.

Способность некоторых штаммов молочнокислых бактерий продуцировать ЭПС используют в молочной промышленности за рубежом для улучшения реологических характеристик кисломолочных и других молочных продуктов. Из-за высокой водосвязывающей способности наличие ЭПС уменьшает количество выделившейся сыворотки во время производства и в готовом продукте, а также при хранении [4]. ЭПС, являясь водосвязывающими агентами, уменьшают количество свободной влаги в продукте, тем самым увеличивая хранимоспособность продукта [5].

В иностранных источниках информации сообщается о функциональной роли полисахаридов, синтезируемых молочнокислыми бактериями, в частности, что они проявляют в организме человека противоязвенную и иммуномодулирующую активность [6, 7, 8].

Известны за рубежом штаммы родов Sphingomonas, Pseudomonas и Agrobacterium, синтезирующие ЭПС [9, 10]. Но данные микроорганизмы не имеют статуса пищевых, т.е. не могут использоваться в производстве молочных продуктов.

За рубежом запатентованы штаммы Streptococcus thermophilus и Lactobacillus sake, синтезирующие экзополисахариды, используемые при изготовлении продуктов. В патентах описана морфология, ростовой оптимум, способность ферментировать сахара и способность к синтезу экзополимеров. Указано, что штаммы и их выделенные полисахариды можно использовать для приготовления диетических композиций [11, 12].

Наиболее близким аналогом изобретения является патент WO 03102204; С 12 Р 19/04; А 23 С 9/123; Novel Streptococcus thermophilus strains producing stable high-molecular-mass exopolysaccharides. De Vuyst L., Vaningelgem F., опубликованный 11.12.2003, в котором патентуется новый штамм Streptococcus thermophilus, продуцирующий растворимые высокомолекулярные экзополисахариды. Штамм задепонирован под номером LMP Р-21524, относится к культурам с функциональными свойствами благодаря продуцированию высокомолекулярных экзополисахаридов. Культура, как продуцент ЭПС, или чистые ЭПС используются в пищевых продуктах для придания продукту функциональных свойств, улучшения реологических свойств, а также как водосвязывающий агент. Охарактеризована молекулярная масса, структура, состав гетерополисахаридов. Подобрана питательная среда для культивирования штамма - молоко с гидролизатом лактальбумина.

Таким образом, анализ представленных выше данных свидетельствует о том, что на современном этапе перспективным для пищевой промышленности нашей страны является получение и использование в процессе производства кисломолочных продуктов отечественных штаммов микроорганизмов со способностью синтезировать экзополимеры, классифицированных как GRAS (широко признанные как безопасные), к которым относятся молочнокислые бактерии [13].

Известны способы получения ЭПС штаммов с увеличенным синтезом ЭПС с помощью генетических манипуляций [14, 15, 16, 17] и путем изменения условий культивирования для микроорганизмов рода Sphingomonas и Streptococcus [9, 18]. Анализ имеющихся данных позволяет заключить, что условия для продуцирования ЭПС для каждого штамма индивидуальны и поэтому в каждом конкретном случае необходимо выявлять рациональные параметры культивирования для обеспечения максимальной ЭПС-активности бактерий.

В отличие от имеющихся патентов впервые предлагается ЭПС-активный штамм молочнокислых бактерий, относящийся к другой таксономической группе, а именно к Lactococcus lactis subspecies lactis. Предлагаемый штамм молочнокислых бактерий Lactococcus lactis subspecies lactis LLN-E2 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-8558, относится к мезофильным и может быть использован как импортозамещающий штамм в качестве продуцента растворимых экзополисахаридов при производстве молочных продуктов.

Новый штамм Lactococcus lactis subspecies lactis ВКПМ В-8558 характеризуется культурально-морфологическими, генетическими, физиолого-биохимическими признаками и технологическими свойствами.

Штамм Lactococcus lactis subspecies lactis ВКПМ В-8558, по паспорту выделенный из обогащенной культуры на основе самоквасного творога, полученного из коровьего молока. Штамм Lactococcus lactis subspecies lactis ВКПМ В-8558 представляет собой грамположительные, факультативно-анаэробные, неспорообразующие, неподвижные, каталазоотрицательные кокки. Клетки располагаются поодиночке, в парах и в цепочках разной длины. При выращивании в жидком гидролизованном молоке растет по всей высоте объема, в жидкой сывороточной среде - с образованием осадка биомассы, а на стерильном обезжиренном молоке - образует равномерный по всему столбику молочный сгусток. На поверхности плотных питательных сред (гидролизованное молоко с агаром, М02 и MRS) образует овальные и круглые колонии, располагающиеся как на поверхности, так и в глубине среды культивирования.

Содержание ГЦ в ДНК составляет 37,5 мол.%, что подтверждает его таксономическую принадлежность к роду Lactococcus. Штамм Lactococcus lactis subspecies lactis ВКПМ В-8558 имеет две плазмиды (фиг.1). Изучена стабильность сохранения свойств у данного штамма, в результате которой можно заключить, что штамм стабильно сохраняет свои свойства.

Оптимальная температура развития (26-34)°С, рН питательных сред - 7,2±0,2; не образует каталазу; желатину не разжижает. Продуцирует преимущественно L(+)-изомер молочной кислоты; устойчив к 0,4% фенола и 2% NaCl.

Активность сквашивания стерильного молока при внесении 5% штамма составляет 7,0-8,0 ч, энергия кислотообразования через 7,5 ч культивирования в молоке - (60-67)°Т. Количество клеток на стерильном обезжиренном молоке в среднем составляет 2×10⁸-5×10⁸ в 1 см³. Влагоудерживающая способность сгустка, образуемого в молоке, составляет (3,5-4,5) см³. Предел кислотообразования на стерильном обезжиренном молоке составляет (94±5,0)°Т. При развитии в молоке нормального состава образует вязкий сгусток, имеющий слизистую консистенцию и обладающий чистым кисломолочным вкусом без посторонних привкусов и запахов. Продуцирует фермент β-галактозидазу: индекс лактозосбраживающей активности - 0,63.

Отличительной особенностью Lactococcus lactis subspecies lactis ВКПМ B-8558 является его природная способность к продуцированию достаточно высокого количества растворимых экзополисахаридов при различных условиях культивирования (0,075-0,105 г/100 см³), причем данное свойство стабильно сохраняется.

Для штамма Lactococcus lactis subspecies lactis ВКПМ B-8558 была получена индивидуальная генетическая характеристика с помощью технологии ДНК-фингерпринтинга с проведением дальнейшего анализа наборов продуктов амплификации, которая позволяет при промышленном использовании осуществить защиту авторских прав (фиг.2).

Известно, что способы использования каждого штамма с ЭПС способностью индивидуальны, т.е. к различных условиях штаммы синтезируют различные количества ЭПС и с целью максимализации синтеза ЭПС определяются специальные условия культивирования. Для этого необходимым является способ получения ЭПС штамма с максимальной активностью к продуцированию полимеров для использования в производстве молочных продуктов с целью получения высоких реологических показателей.

Предлагаемый способ отличается условиями культивирования штамма Lactococcus lactis subspecies lactis ВКПМ В-8558 для получения максимального количества ЭПС, который включает: приготовление питательной среды (состав среды на 1 л: 230÷270 мл (90÷140 г) молочная сыворотка (творожная или подсырная, осветленная), 230÷270 мл концентрированное гидролизованное молоко, 1,8÷2,3 г KH₂PO₄, 2,2÷2,8 г Na₂HPO₄, 0,08÷0,15 г MgSO₄, 5÷8 г лимоннокислый натрий, дистиллированная вода (до 1 л)). Сухую сыворотку восстанавливают, раскисляют (25% NH₄OH или 40% раствором NaOH) до рН=6,5÷6,7, выдерживают в течение 20-30 минут. Затем фильтруют и вносят другие компоненты, размешивают, разливают в емкости и стерилизуют при t=117±1°С (0,8 атм) в течение 40 минут, проведение ферментации в условиях полунепрерывного глубинного культивирования при температуре 22÷32°С на приготовленной питательной среде в течение 7,5÷14 ч при постоянном значении рН, равном (6,5±0,5), при которых накапливается достаточное количество живых клеток - (8,4÷9,5) lg КОЕ в 1 см³ и максимальное количество ЭПС - 0,075÷0,105 г/100 см³. После культивирования проводится центрифугирование биомассы клеток с культуральной жидкостью на центрифуге с охлаждением при 2800-3500 об/мин в течение 10-25 мин. Затем осадок, составляющий полученную биомассу, ресуспендируют в защитной среде в соотношении 1:1 или 1:2. В качестве криопротектора используют обезжиренное молоко с повышенной массовой долей сухих веществ (до 15%) или обезжиренное молоко, смешанное с желатином в одинаковом соотношении. Далее проводят замораживание стартерной культуры при температуре не выше минус 30±2°С. Высушивание проводят сублимационным способом до достижения в сухой биомассе массовой доли влаги не более 4%. После сушки биомассу во флаконах стерильно укупоривают или расфасовывают в герметичные упаковочные материалы. Хранят сухую стартерную ЭПС-культуру при температуре минус 18±2°С не более 6 месяцев.

Технический результат от реализации изобретения заключается в социальном эффекте, направленном на оздоровление населения и получение натурального продукта без включения пищевых добавок, и экономическом эффекте, полученном при исключении из производства стадии покупки, проверки на качество, приготовления и внесения пищевой добавки. Данная цель достигается за счет использования штамма Lactococcus lactis subspecies lactis ВКПМ В-8558, продуцирующего ЭПС (0,075÷0,105 г/100 см³), что улучшает реологические показатели продукта без внесения пищевой добавки и способствует усилению функциональных свойств получаемых продуктов с использованием данного штамма молочнокислых бактерий.

Пример 1.

Готовят питательную среду (на 1 л): 250 мл (100 г) молочная сыворотка (творожная, осветленная), 250 мл концентрированное гидролизованное молоко, 2 г КН₂РО₄, 2,5 г Na₂HPO₄, 0,12 г MgSO₄, 6 г лимоннокислый натрий, дистиллированная вода (до 1 л). Сухую сыворотку восстанавливают, раскисляют (25% NH₄OH) до рН=6,5, выдерживают в течение 20 минут. Затем фильтруют и вносят другие компоненты, размешивают, разливают в емкости и стерилизуют при t=117°C (0,8 атм) в течение 40 минут, затем охлаждают до температуры 22°С. В приготовленную питательную среду, находящуюся в ферментере в количестве 1 л, вносят 50 мл активизированной культуры Lactococcus lactis subspecies lactis ВКПМ В-8558. После чего начинают процесс наращивания бактериальной биомассы, осуществляемый при температуре 22°С, рН=7,0 в течение 14 часов. Затем биомассу центрифугируют, смешивают с защитной средой (обезжиренное молоко с желатином в соотношении 1:1), замораживают при температуре минус 30°С и сушат методом сублимации до массовой доли влаги в сухой биомассе не более 4%. После сушки биомассу во флаконах стерильно укупоривают или расфасовывают в герметичные упаковочные материалы. Хранят сухую стартерную культуру при температуре минус 18±2°С не более 6 месяцев.

Пример 2.

Готовят питательную среду (на 1 л): 230 мл (90 г) молочная сыворотка (подсырная, осветленная), 270 мл концентрированное гидролизованное молоко, 1,8 г КН₂PO₄, 2,2 г Na₂HPO₄, 0,08 г MgSO₄, 5 г лимоннокислый натрий, дистиллированная вода (до 1 л). Сухую сыворотку восстанавливают, раскисляют (40% раствором NaOH) до рН=6,7, выдерживают в течение 30 минут. Затем фильтруют и вносят другие компоненты, размешивают, разливают в емкости и стерилизуют при t=118°C (0,8 атм) в течение 40 минут, затем охлаждают до температуры 27°С. В приготовленную питательную среду, находящуюся в ферментере в количестве 1 л, вносят 50 мл активизированной культуры Lactococcus lactis subspecies lactis ВКПМ В-8558. После чего начинают процесс наращивания бактериальной биомассы, осуществляемый при температуре 27°С, рН=6,5 в течение 11,5 часа. Затем биомассу центрифугируют, смешивают с защитной средой (обезжиренное молоко с желатином в соотношении 1:1), замораживают при температуре, равной минус 32°С, и сушат методом сублимации до массовой доли влаги в сухой биомассе не более 4%. После сушки биомассу во флаконах стерильно укупоривают или расфасовывают в герметичные упаковочные материалы. Хранят сухую стартерную культуру при температуре минус 18±2°С не более 6 месяцев.

Пример 3.

Готовят питательную среду (на 1 л): 270 мл (140 г) молочная сыворотка (творожная, осветленная), 230 мл концентрированное гидролизованное молоко, 2,3 г КН₂РО₄, 2,8 г Na₂HPO₄, 0,15 г MgSO₄, 8 г лимоннокислый натрий, дистиллированная вода (до 1 л). Сухую сыворотку восстанавливают, раскисляют (40% раствором NaOH) до рН=6,6, выдерживают в течение 25 минут. Затем фильтруют и вносят другие компоненты, размешивают, разливают в емкости и стерилизуют при t=116°C (0,8 атм) в течение 40 минут, затем охлаждают до температуры 32°С. В приготовленную питательную среду, находящуюся в ферментере в количестве 1 л, вносят 50 мл активизированной культуры Lactococcus lactis subspecies lactis ВКПМ В-8558. После чего начинают процесс наращивания бактериальной биомассы, осуществляемый при температуре 32°С, рН=6,0 в течение 7,5 часов. Затем биомассу центрифугируют, смешивают с защитной средой (обезжиренное молоко с повышенной массовой долей сухих веществ (12%)), замораживают при температуре, равной минус 28°С, и сушат методом сублимации до массовой доли влаги в сухой биомассе не более 4%. После сушки биомассу во флаконах стерильно укупоривают или расфасовывают в герметичнее упаковочные материалы. Хранят сухую стартерную культуру при температуре минус 18±2°С не более 6 месяцев.

Литература

1. Грешнов А.Г., Взоров А.Л., Никитков В.А. Пищевые добавки фирмы The Nutra Sweet Kelco Company (Великобритания). // Пищевая промышленность. - 1997. - №11 - с.68-71.

2. Degeest Bart, Vaningelgem Frederic, Luc De Vuyst Microbial physiology, fermentation kinetics, and process engineering of heteropolysaccharide production by lactic acid bacteria. // International Dairy Journal, 11, 2001, p.747-757.

3. Новик Г.И., Астапович Н.И., Кюблер И., Гамьян А. Характеристика полисахаридов, секретируемых Bifidobacterium adolescentis 94 БИМ. // Микробиология. - 2002. - Том 71. - №2. - с.205-210.

4. Hartley D.L., Denariaz G. The role of lactic acid bacteria in yogurt fermentation. // Int. J. Immunotherapy. - 1993. - 9(1) - P.3-17.

5. Ricciardi А. и Clementi F. Exopolysaccharides from lactic acid bacteria: structure, production and technological applications. // Ital. Journal Food Sci. - 2000 - Vol.12. - №1. - P.23-45.

6. Stigele F., Sebastien J.F. Vincent, Faber E.J., Newell J.W., Kamerling J.P. и Neeser J.R. Introduction of the exopolysaccharide gene cluster from Streptococcus thermophilus Sfi6 into Lactococcus lactis MG1363: production and characterization of an altered polysaccharide. // Molecular Microbiology. - 1999 - Vol.32. - №6. - Р.1287-1295.

7. Патент 2002010242 Республика Корея, Int: C 12 N 1/20; Eur: A 61 K 31/715; Microorganism isolated from Chinese elm (Ulmus sp.) and method for producing immunostimulating exopolysaccharide having anticancer activity using the same microorganism. Yang и др. Опубл. 04.02.2002., http:v3.espacenet.com.

8. Патент 5700787 США, Int: A 61 K 31/715; Eur: A 61 K 39/02; Capsular polysaccharide immunomodulator. Trianabos и др. Опубл. 23.12.1997., http:v3.espacenet.com.

9. Патент 2004077056 США, Int: C 08 B 37/00; Eur: C 08 B 37/00; Production of exopolysaccharides unattached to the surface of bacterial cells. Yamazaki M., Armentrout R. и др. Опубл. 22.04.2004., http: v3.espacenet.com.

10. Патент 4567140 США, Int: C 12 P 39/00; Eur: C 12 P 19/04; Microbial polysaccharides, process for their preparation, microorganisms suitable for this and use of the polysaccharides. Voelskow и др. Опубл. 28.01.1986., http:v3.espacenet.com.

11. Патент 2004023361 США, Int: A 61 K 31/715; Eur: C 12 P 19/04; Lactic acid bacteria producing polysaccharide similar to those in human milk and corresponding gene. Pot В., Neeser J.R. и др. Опубл. 05.02.2004., http:v3.espacenet.com.

12. Патент 5834043 США, Int: A 23 C 9/12; Eur: A 21 D 2/18 B; Lactobacillus sake like strains, production and use of their exopolysaccharide. Ledeboer A.M., Vreeker R. и др. Опубл. 10.11.1998., http:v3.espacenet.com.

13. Degeest В., Mozzi F., De Vuyst L. Effect of medium composition and temperature and pH changes on exopolysaccharide yields and stability during Streptococcus thermophilus LY03 fermentations. // International Journal of Food Microbiology 79 (2002) p.161-174.

14. Патент 5639601 Австралия, Int C 12 N 15/31; Eur: C 12 N 15/52; Streptococcus thermophilus operons involved in exopolysaccharide (eps) synthesis. Mengaud J., Rallu F. и др. Опубл. 30.10.2001., http:v3.espacenet.com.

15. Патент 9962316 Всемирная организация по охране интеллектуальной собственности (ВОИС), Eur: C 12 N 9/10 D1; Lactic acid bacteria producing exopolysaccharides. Germond J.E. и др. Опубл. 09.12.1999., http:v3.espacenet.com.

16. Патент 280974 Новая Зеландия, Int C 12 N 15/52; Eur: C 12 N 15/52; Lactic bacterium DNA coding for enzymes involved in exopolysaccharide (EPS) production and its use. Mollet B. and Stingele F. Опубл. 26.08.1998., http:v3.espacenet.com.

17. Патент 2002130709 Россия, C 12 N 9/90; Сверхпродуцирование экзополисахаридов мутантами молочнокислых бактерий. Анба Ж. Ажеж Ж. и др. Опубл. 20.04.2004., http://www.rupto.ru.

18. Патент 03102204 Всемирная организация по охране интеллектуальной собственности (ВОИС), Int C 12 P 19/04; Eur: А 23 С 9/123 Н; Novel Streptococcus thermophilus strains producing stable high-molecular-mass exopolysaccharides. De Vuyst L., Vaningelgem F. Опубл. 11.12.2003., http: v3.espacenet.com.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, молочной промышленности и может быть использовано в производстве молочных продуктов с высокими реологическими и качественными показателями. Изобретение касается нового отечественного природного штамма молочнокислых бактерий Lactococcus lactis subspecies lactis ВКПМ B-8558, отличительной особенностью которого является способность синтезировать экзополисахариды в количестве, обеспечивающем улучшение реологических показателей продукта без внесения пищевой добавки и способствующего усилению функциональных свойств продуктов, получаемых с использованием данного штамма молочнокислых бактерий. Стартерную культуру штамма Lactococcus lactis subspecies lactis ВКПМ B-8558 получают ферментацией в условиях полунепрерывного глубинного культивирования на питательной среде, содержащей молочную сыворотку, концентрированное гидролизованное молоко, KH₂PO₄, Na₂HPO₄, MgSO₄, лимоннокислый натрий и дистиллированную воду. Ферментацию ведут при температуре 22÷32°С, постоянно поддерживаемом значении рН 6,0÷7,0 до накопления количества живых клеток - 8,4÷9,5 lg KOE/см³ и содержания экзополисахаридов - 0,075÷0,105 г/100 см³. Отделяют биомассу, ресуспендируют в защитной среде, использующей в качестве криопротектора обезжиренное молоко с повышенной массовой долей сухих веществ (до 15%) или обезжиренное молоко, смешанное с желатином в одинаковом соотношении, замораживают и высушивают сублимацией. После сушки биомассу во флаконах стерильно укупоривают или расфасовывают в герметичные упаковочные материалы. Изобретение позволяет получать стартерную культуру с максимальной ЭПС активностью, что будет способствовать получению кисломолочных продуктов с высокими реологическими показателями, придающих продукту требуемую консистенцию, более длительными сроками годности и функциональными свойствами. 2 н.п. ф-лы, 2 ил.

1. Штамм бактерий Lactococcus lactis subspecies lactis ВКПМ B-8558, используемый в производстве молочных продуктов.2. Способ получения стартерной культуры штамма Lactococcus lactis subspecies lactis ВКПМ B-8558, предусматривающий приготовление питательной среды, содержащей молочную сыворотку - 230÷270 мл (90÷140 г), концентрированное гидролизованное молоко - 230÷270 мл, KH₂PO₄ - 1,8÷2,3 г, Na₂HPO₄ - 2,2÷2,8 г, MgSO₄ - 0,0 8÷0,15 г, лимоннокислый натрий - 5÷8 г, дистиллированную воду (до 1 л), стерилизацию, охлаждение, внесение активированной культуры Lactococcus lactis subspecies lactis ВКПМ B-8558 и ферментацию в условиях полунепрерывного глубинного культивирования при температуре 22÷32°С при постоянно поддерживаемом значении рН 6,0÷7,0 до накопления количества живых клеток 8,4÷9,5 lg KOE/см³ и содержания экзополисахаридов 0,075÷0,105 г/100 см³, отделение биомассы, ресуспендирование в защитной среде, замораживание и последующее сублимационное высушивание.