СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВИРУССОДЕРЖАЩЕГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ АНТИРАБИЧЕСКОЙ ВАКЦИНЫ Российский патент 1997 года по МПК C12N7/00 A61K39/205 

Изобретение относится к медицинской промышленности, в частности к производству вирусных препаратов.

Прототипом изобретения является применяемый в настоящее время способ получения вируссодержащего материала для изготовления коммерческой культуральной антирабической вакцины. Метод основан на псевдосуспензионном культивировании в стеклянных 50 л ферментерах клеток почек сирийского хомяка и фиксированного вируса бешенства Внуково-32. Процесс культивирования включает в себя следующие этапы. После трипсинизации клетки почек сирийского хомяка (ПСХ) заражают во взвесь фиксированным вирусом бешенства штамма Внуково-32 путем адсорбции вируса на клетках в течение 1-1,5 ч. Зараженные клетки вместе с микроносителями загружают в 50 л биореактор. На 4-5-й день проводят смену среды. По истечение 9-10-ти суток с момента загрузки биореактора производится отмыв культуры клеток от сыворотки крупного рогатого скота (КРС). На 3-й день после отмыва проводится 1-й сбор. Сборы делаются через день, максимальное количество сборов с одного биореактора 8. Инфекционный титр вируссодержащей жидкости 6,0-7,5 lg ЛД50/мл.

Недостатком этого метода является ограниченное количество сборов, обусловленное динамикой накопления вируса в виде затухающей синусоиды (кривая 1). Это также не позволяет получать сборы с более высоким инфекционным титром. Кроме того, процесс получения вируссодержащего материала очень длительный; один цикл составляет 22-24 дня. Использование в 40-х годах нашего столетия первичнотрипсинизированных клеток ПСХ явилось крупным шагом на пути создания эффективных вакцин. В настоящее время эти клетки не могут считаться перспективным субстратом, так как существуют определенные трудности в их использовании и характеристике. Основными причинами наблюдающейся в мире тенденции перехода на перевиваемые гетероплоидные линии клеток вместо первичных являются потенциальная опасность последних, связанная с контаминацией посторонними агентами, нестандартность (неоднородность качества) и разная чувствительность к одному и тому же вирусу различных партий культур клеток. Перевиваемые клетки экономичны в получении, более стандартны, могут выращиваться в больших объемах и дают высокий урожай вируса на единицу объема в непрерывных культурах, а воспроизводство культур осуществляется при постоянных условиях с контролируемыми параметрам.

За рубежом на перевиваемых гетероплоидных клетках в биореакторе на микроносителях изготавливают вакцины против бешенства и полиомиелита. Культивирование вируса бешенства штамма Питманн-Море PM 1503-3М осуществляют в ферментерах на микроносителях Cytodex 1. Данные о выходе, количестве вируссодержащего материала и оптимальных условиях его получения отсутствуют.

Задача, решаемая изобретением, повышение выхода вируссодержащей массы за счет оптимизации процесса культивирования вируса в биореакторе на микроносителях.

Поставленная задача решается путем осуществления способа, включающего культивирование в биореакторе вируса бешенства штамм Внуково-32 в клетках с использованием микроносителей с последующими сборами вируссодержащей жидкости, при котором в качестве клеточного субстрата используют гетероплоидные перевиваемые клетки Vero и заражают их адаптированным к ним штаммом вируса бешенства Внуково-32, а на 4-7-е сутки от начала культивирования производят подсев в биореактор свежей порции зараженных вирусом клеток.

Сравнительный анализ существенных признаков изобретения и прототипа свидетельствует, что общими признаками для них являются: культивирование в биореакторе вируса бешенства штамма Внуково-32 в клетках с использованием микроносителей с последующими сборами вируссодержащей жидкости. Однако в отличие от прототипа в заявляемом способе используют перевиваемые гетероплоидные клетки Vero и адаптированный к ним штамм вируса бешенства Внуково-32 и на 4-7-е сутки от начала культивирования производят подсев в биореактор зараженных вирусом клеток на микроносителях.

Как видно на представленных графиках (см. чертеж) проведение процесса на перевиваемых гетероплоидных клетках с подсевом зараженных вирусом клеток на микроносителях на 4-7-е сутки культивирования позволяет избежать снижения инфекционного титра вируса после первого пика на кривой 1 (способ-прототип), так как максимум инфекционного титра подсеянных зараженных клеток приходится на период снижения инфекционного титра вируса, культивируемого в ферментере. Графически это будет представлять собой сплошную линию, соединяющую два максимума накопления вируса (кривая 2). Теоретически этот процесс можно продолжать бесконечно долго, осуществляя в определенные дни подсев свежей порции зараженной клеточной культуры.

Такое ведение процесса культивирования позволяет оптимизировать способ получения вируссодержащего материала, увеличить количество сборов за один цикл до 16 и больше и повысить инфекционный титр вируса до 7,0-9,5 lg ЛД50/мл.

Указанные отличительные признаки в литературе не описаны, а их влияние на достижение технического результата не следует из известного уровня техники, т.е. заявляемый способ соответствует условиям "новизна" и "изобретательский уровень".

Способ осуществляют следующим образом.

Для получения вируссодержащего материала используют перевиваемые гетероплоидные клетки Vero. Клетки снимают с поверхности роллеров и матрасных колб смесью версена и химопсина по общепринятой методике и клеточную взвесь заражают адаптированным к этим клеткам фиксированным вирусом бешенства штамма Внуково-32 путем адсорбции вируса на клетках на магнитной мешалке в течение 1-1,5 ч. Зараженные вирусом клетки, доза вируса 0,1-0,001 ЛД50/кл, в концентрации 0,5-1,0х10 кл/мл, соединяют с ростовой средой, в качестве которой используется питательная среда Игла МЕМ с добавлением 7%-ной сыворотки КРС, загружают в стеклянный реактор фирмы "Tehne" вместимостью 3 л и добавляют микроносители "Цитолар-2". Микроносители "Цитолар" выпускаются НПО "Биолар", г. Олайне, Латвия. Микроносители представляют собой частицы поперечно-сшитого денатурированного коллагена (желатина), синтезированного по оригинальной технологии. Все компоненты, из которых синтезированы микроносители "Цитолар", применяются в медицинской практике, а полученный продукт является биологически совместимым материалом. Микроносители гидрофильны, прозрачны, имеют гладкую поверхность, в изотоническом солевом растворе их удельная плотность не превышает 1,08 г/см, диаметр частиц 110-280 мкм (см. проспект "Цитолар микроносители для культивирования поверхностнозависимых клеток". НПО "Биолар", г. Олайне, Латв. ССР, 1985 г.).

Концентрация микроносителей 3 мг/мл ростовой среды.

Биореактор помещают на подставку с вмонтированной в нее магнитной мешалкой и блоком управления, устанавливают ее в термальной комнате с температурой (36+1)^oС и осуществляют стандартный режим перемешивания. Скорость вращения мешалки 25 об./мин.

На 3-4-е сутки по результатам визуального контроля качества монослоя проводят смену ростовой среды на поддерживающую, в качестве которой используется питательная среда Игла МЕМ с добавлением 1%-ной сыворотки КРС.

На 4-7-е сутки производят подсев в биореактор свежей порции зараженных клеток на микроносителях. Зараженную культуру для подсева можно получить двумя способами: псевдосуспензионным в биореакторе, если таковые имеются в достаточном количестве, и сетчато-роллерным, когда клетки культивируются в роллерных флаконах на микроносителях, где создается дополнительная поверхность за счет образования с помощью последних пристеночной пленки. Практика показывает, что хотя и прикрепление клеток к микроносителям в роллере идет лучше, целесообразнее использовать псевдосуспензионный способ, так как он менее трудоемок.

На 5-6-е сутки начинают делать сборы вируссодержащей жидкости. Сбор проводят следующим образом: после оседания микроносителей вируссодержащую жидкость откачивают через канюлю посредством нагнетания воздуха грушей в заранее приготовленные стерильные флаконы, а затем с помощью положительного давления в биореактор засасывают новую порцию поддерживающей среды и устанавливают его на подставку до следующего сбора. Сборы делают ежедневно, предпочтительное количество сборов с одного биореактора 10. Перед сбором контролируют качество монослоя на микроносителях. Все этапы работы проводят с соблюдением правил асептики в стерильных помещениях.

Пример 1. К взвеси клеток Vero в концентрации 100 тыс. кл./мл, полученных по общепринятой методике, добавляют адаптированный к ним штамм вируса бешенства Внуково-32 из расчета 0,1 ЛД50/кл. Адсорбцию вируса проводят на магнитной мешалке в течение 1-1,5 ч. Зараженные вирусом клетки соединяют с 250 мл ростовой среды, в качестве которой используется питательная среда Игла МЕМ с добавлением 7%-ной сыворотки КРС, загружают в стеклянный реактор фирмы "Techne" вместимостью 3 л и добавляют микроносители "Цитолар-2" в концентрации 3 мг/мл ростовой среды. Культивирование проводят на подставке с вмонтированной в нее магнитной мешалкой и при температуре (36+1)^oC. Скорость вращения мешалки 25 об./мин. На следующие сутки объем ростовой среды в биореакторе доводят до 500 мл. Качество монослоя контролируют визуально ежедневно.

На 3-и сутки проводят смену ростовой среды на поддерживающую, в качестве которой используется среда Игла МЕМ с добавлением 1%-ной сыворотки КРС. На 4-е сутки производят подсев в биореактор свежей порции зараженных клеток, полученных псевдосуспензионным или сетчато-роллерным методом.

Сборы делают ежедневно после смены ростовой среды на поддерживающую.

Пример 2. Проводят, как описано в примере 1, но подсев свежей порции зараженных клеток в биореактор производят на 7-е сутки культивирования.

Определение инфекционного титра вируссодержащего материала, полученного по примерам 1 и 2, проводили по методу Рида-Менча на белых беспородных мышах массой 6-8 г. И в первом, и во втором примерах титры были одинаковы и составили 8,0-9,0 lg ЛД50/мл. Антигенная активность подтверждена в тесте сорбции антител на белых беспородных мышах массой 10-11 г. Индексы антигенности составили выше 2 против 158 ЛД50 вируса CVS.

Как видно из таблицы, за один и тот же период времени заявляемый способ позволяет получить в 2 раза больший объем вируссодержащего материала с более высоким инфекционным титром, в среднем на 1,5-2 lg ЛД50 выше. При этом средняя продолжительность одного цикла культивирования составляет 12-14 дней.

Таким образом, оптимизация процесса культивирования вируса в заявляемом способе обеспечивает возможность проведения ежедневных сборов с биореатора вируссодержащего материала, а следовательно, увеличение его выхода по сравнению со способом-прототипом в 2 раза.

Использование: медицинская промышленность. Сущность изобретения: для получения вируссодержащего материала используют перевиваемые гетероплоидные клетки Vero. К взвеси клеток в концентрации 100 тыс. кл./мл добавляют адаптированный к ним штамм вируса бешенства Внуково-32 из расчета 0,1 ЛД50/кл. Культивирование проводят в биореакторе фирмы "Techne" вместимостью 3 л с добавлением микроносителей "Цитолар-2" в концентрации 3 мг/мл ростовой среды. На 3-и сутки проводят смену ростовой среды на поддерживающую. На 4-7-е сутки производят подсев в биореактор свежей порции зараженных клеток, полученных псевдосуспензионным или сетчато-роллерным методами. Сборы делают ежедневно после смены ростовой среды на поддерживающую. 1 ил., 1 табл.

Способ получения вируссодержащего материала для изготовления антирабической вакцины, включающий культивирование в биореакторе клеток и вируса бешенства штамм Внуково-32 с использованием микроносителей с последующими сборами вируссодержащей жидкости, отличающийся тем, что из клеток используют гетероплоидные перевиваемые клетки Vero, а на 4 7 сут от начала культивирования производят подсев в биореактор новой порции зараженной клеточной культуры.