Способ размножения вирусов гриппа Советский патент 1992 года по МПК C12N7/00 A61K39/145 

С/)

с

Использование: вирусология, иммунология. Сущность изобретения: систему для размножения вируса (куриные эмбрионы, культуры клеток куриных фибробластов или взвесь свежетрипсинизированных клеток почек хомяка) обрабатывают электромагнитными полями: постоянным с напряженностью 100-5000 Э в течение 5-40 мин или переменным с напряженностью 1000-5000 Э в течение 10-35 мин с периодом колебаний 50-60 с. Обработку проводят до заражения вирусом. Титры вирусов гриппа увеличиваются на 1,03-4,8 логарифма ЭМДбо. 2 з.п.ф-лы, 1 ил., 8 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к вирусологии, и может быть использовано о практической работе со штаммами вирусов гриппа для получения высокопродуктивных вариантов.

Цель изобретения - повышение титров вирусов гриппа.

Предложенный способ заключается в том. что на 10-11 дневные куриные эмбрионы, культуры клегок или свежетрипсинизи- рованные взвеси клеток почек сирийского хомяка воздействуют постоянным электромагнитным полем (пост. ЭМП) в дозах 100- 5000 Э в течение 5-40 мин или колеблющимся электромагнитным полем ЭМП 1000-5000 Э в течение 10-35 минут с периодом колебаний 50-60 с. Затем производят заражение куриных эмбрионов или выросших культур клеток одним из штаммов вирусов гриппа, инкубируют их в термостзте при температуре (35 ± 1)°С и собирают вируссодержащую жидкость известными способами. В ней определяют гемагглюти- нирующие и инфекционные титры. Предложенный способ осуществляют в следующих вариантах.

Вариант. Воздействие на куриные эмбрионы постоянного электромагнитного поля (пост.ЭМП) разной напряженности.

Куриные эмбрионы (КЭ) помещают между полюсами электромагнита в вертикальном положении тупым концом вверх на какой-нибудь подставке, например из пенопласта или полиуретана. Воздействие ЭМП осуществляют в течение 5-30 мин. В качестве контроля служат КЭ, помещенные за пределами воздействия поля. Затем производят их заражение вирусом.

После заражения омагниченные и контрольные эмбрионы инкубируют известым способом и отсасывают аллантоисную идкость.

П р и м о р 1. Пост. ЭМП напряженнотью 100-5000 Э. Время обработки 5 мин. Вирусный штамм-рекомбинант X 53-А (Н виной, № 1). Обработку полем проводят пособом, олмсанным выше, после чего заажают вирус ом опытные и контрольные мбрионы.

Гемогглютинирующие титры определеы в реакции гемагглютинации с 1%-ной взвесью эритроцитов кур. Инфекционные итры на КЭ вычислены по Риду и Менчу. Результаты этого опыта приведены в таблице 1.

Средние данные титров рекомбинант- ного вируса X 53-А после омагничивзния куриных эмбрионов пост, ЭМП разной на- пряжйнкбсти представлены в табл.1.

Как видно из таблЛ, достигнуто увеличение титров вируса при всех значениях поя с максимумом в дозах 4500-5000 Э.

П р и м е р 2. В опыте используют низ- колродуктивный штамм А/Викто- рИя/Зб/72, применяя пост.ЭМП 1000 Э при различном времени воздействия. Эти данные приведены в табл.2.

Как видно из табл.2, наблюдается увеличение титров вируса гриппа А/Виктория при обработке в течение 10-30 мин.

П рим е рЗ. Опыт проводят аналогично примеру 2, используя рекомбинонтный штамм вируса гриппа Х-53-А(Н свиной, №1). Результаты приведены в табл.3,

В данном примере наибольший эффект получен при воздействии постоянного магнитного поля на куриные эмбрионы в течение 5 мин,

При определении инфекционных титров доставлена развернутая реакция гемагглютинации с вируссодоржащим материалом каждого эмбриона. Результаты Приведены в табл.4.

Из табл.4 видно увеличение гемагглго- тинирующих титров в олантоисной жидкости омагничехных эмбрионов. Таким образом, при экспозиции куриных эмбрионов в постоянном электромагнитном поле на первом пассаже достигнуто увеличение титров в предельных разведениях на второй пассаже.

Из приведенных примеров можно сде- ЯаТь следую щие выводы. Выдерживание ку- ри7шх эмбрионов в постоянном электромагнитном поле в течение 5-30 мин в дозе 100-5000 3 позволило увеличить тигры изученных штаммов вирусов гриппа. Время экспозиции и напряженность поля Дли достижения максимального эффекта

были различными в работе с разными штаммами.

Так, у рекомбинантэ Х-53-А кратность прироста ГЕ-тйгров была в раза, инфекционных на 1,5-3,1 логарифма ЭИДво при экспозиции в поле 5-10 мин с максимумом эффекта в 1000-5000 Э (см. табл. 1, 3),

У низкопродуктивного штамма H2N2 (Л/Викгорпя/72) ГЕ-титры увеличивались в

0 2 раза, инфекционная активность на 1-2,0 логарифма.

В опытах были использованы также штаммы A/Texac/77(H3N2), А/Киев (H1N1), получены аналогичные результаты.

5Время от обработки куриных эмбрионов до их заражения не влияло на титры вируса, Как правило, эффект омагничива- ния сохранялся длительное время. Следует отметить, что сильные поля 7000 и 10000 Э

0 не приводили к дальнейшему увеличению титров вируса.

В этом варианте достигнуто также увеличение титров изученных штаммов в предельных разведениях () (см.

5 табл.4)

В а р и, а н т 2. Воздействие постоянного электромагнитного поля на культуру клеток куриных фибропластов.

П р и м е р 4. На монослой выросшей

0 культуры клеток куриных фибропластов (КФ) воздействуют постоянным электромагнитным полем в дозе 1000 Э в течение 5,10, 15 и 30 мин. Пробирки с культурой подвешивают между полюсами магнита или укрепля5 ют на подставке. После опыта питательную среду сливают, клетки отмывают от следов сыворотки и производят заражение вирусным штаммом А/Ленинград/0139 (H2N2) с множественностью заражения 0,1 ЭИДзона

0 клетку. Через 1 ч адсорбции вируса его сливают и вносят среду репродукции, например 199. Контролем служат пробирки с культурой клеток, зараженные вирусом, помещенные за пределами воздействия поля,

5 Зараженные клетки культивируют в термостате при температуре , делая сборы вируссодержащей жидкости (ВЖ) через каждые 2-0 дня. На 5-й день меняют среду репродукции. В ВЖ определяют гемагглю0 тинирующие титры с %-ной взвесью эритроцитов кур и инфекционные - заражением куриных эмбрионов. Результаты приведены в табл.5. Как видно из табл.5, достигнуто увеличение титров вируса А/Ленинг5 рад/0139 в культуре клеток КФ, выдержанной в постоянном электромагнитном поле 10-30 мин.

В.а р и а н т 3, Воздействие колеблющегося электромагнитного поля (колеб.ЭМП) на свежетрипсинизированные клетки почек

сирийского хомяка (ПСХ) в дозах 1000-4000 Э с периодом колебаний БОгбО с, в течение 10-35 мин.

П р и м е р 5. Колеблющееся электромагнитное поле 1000 Э. Время обработки 10 и 15 мин. Свежетрипсинизированные клетки ПСХ распределены по пробиркам в количестве 6 мл и подвешены в свободном состоянии между полюсами стационарного электромагнита. Контролем служат пробирки с клетками за пределами воздействия поля. Затем клетки суспендированы с питательной среде Игла с 10% сыворотки и распределены по ростовым сосудам. Выращивание стационарным способом. Клетки культивируют в термостате до обра- зо вания монослоя, после чего заражают вирусом гриппа описанным ранее способом (см.с.1). В данном-примере использованы штаммы А/Ленинград/0139 (H2N2) и А/Те- хас/77 (H3N2). Множественность заражения 0,005 ЭИД50 на клетку. Сборы ВКЖ сделаны на 3,4-е сут и на 3-е сут после смены среды (второй урожай вируса). В матрасиках с клетками, обработанными магнитным полем, на сутки раньше появились признаки интенсивной репродукции вируса, проявляющееся в специфическом ЦПД.

На чертеже представлена графическая характеристика электромагнитного колеблющегося поля, используемого в данном ва- рианте (период колебаний 50 с).

Как видно из чертежа, напряженность поля возрастала с 0 до 1000 Э в течение 25 с и снижалась до 0 в последующие 25 с, что усиливало биологическое действие его на клетки.

В табл.6 части А приведены средние величины титров вируса А/Ленинг- рад/385/80, в части Б табл.6 - титры вируса А/Техас/77 в культуральной жидкости клеток почек хомяка. Из таблицы 6 отчетливо видно увеличение титров обеих вирусов по гемагглютинации в 1,3-2,6 раза в первом урожае и в 8-16 раз во втором. Инфекцион- ные титры при этом увеличились на 0,7-2,2 логарифма ЭИДзо и на 1,25-3 логарифма соответственно во втором.

П р и м е р 6. Проводят обработку взвеси клеток ПСХ колеблющимся электромагнитным полем с последующим культивировани- ем двумя разными способами - стационарным (в матрасах) и в вращающихся сосудах (роллерным). Для заражения культур клеток используют штамм вируса А/Киев/5979 (H1N1). Множественность заражения 0,05 ЭИДбо/клетку.

. После экспозиции взвеси клеток, их

разделяют на две порции. Одну вносят в

стеклянные матрасы и культивируют стационарным способом.

Вторую помещают в роллерные сосуды и культивируют на аппарате Ролласелл (США) со скоростью 0,5 об/мин. После обра- 5 зования монослоя их заражает вирусом по обычной схеме. Посевная доза в роллере - 1 млн.клеток/мл (см. табл.7).

Таким образом, обработка колеблющимся электромагнитным полем свеже0 трипсинизированных клеток почек хомяка позволила повысить титры изученных штаммов. Положительный эффект оказался наиболее выраженным в работе с А/Ленинград/0139 (H2N2) (табл.6).

5 Вариант IV. Использование колеблющегося электромагнитного поля для обработки куриных эмбрионов с последующим заражением их вирусами гриппа.

Пример. Проводят обработку 10-11

0 дневных КЗ колеб.ЭМП 5000 Э с графической характеристикой, указанной на чертеже. Затем по обычной схеме их заражают вирусом гриппа А/Техас/77 (H3N2). Время обработки полем 10, 20 и 30 мин. Результа5 ты титрования приведены в таблице 8.

Как видно из табл.8, достигнуто увеличение титров вируса А/Техас/77 после экспозиции куриных эмбрионов в колеб.ЭМП 5000 Э.

0 Следовательно, поставленная цель достигнута - увеличены титры (и соответствен- но репродукция) изученных штаммов вирусов гриппа, при использовании электромагнитных полей найденных характери5 стик: постоянного и колеблющегося - на разных биологических системах, источниках репродукции - куриных эмбрионах и первичных культурах клеток.

Следует отметить, что разные штаммы

0 размножались в омагниченных системах с неодинаковой интенсивностью. Для достижения максимального положительного эффекта необходим подбор параметров опытным путем.

5Метод прост и для достижения данного

способа могут быть использованы любые стационарные электромагниты, позволяющие получить в зазоре между полюсами поля напряженностью до 10000 Э.

0 Применение данного способа позволит увеличить титры вирусов гриппа при размножении их в куриных эмбрионах или культурах клеток, получать варианты штаммов с более высокой продуцирующей активно5 стыо, а также экономить расход куриных эмбрионов и сырья для получения первичных культур клеток за счет увеличения титров в ьируссодержащих жидкостях (алантоисной и культуральной).

Формула изобретения 1. Способ размножения вирусов гриппа, включающий обработку электромагнитным полем куриных эмбрионов или культур клеток, их заражение, инкубацию и сбор вируссодержащей жидкости, отличающийся тем, что, с целью увеличения титров вируса, на куриные эмбрионы ипи культуры клеток воздействуют постоянным электромагнитным полем с напряженностью 100- 5000 Э в течение 5-40 мин или переменным электромагнитным полем 1000-5000 Э с пеЗависимость титров вируса А/Виктория/36/72 (H2N2)oT времени экспозиции куриных

эмбрионов с пост, ЭМП 1000 Э

Та блица 3

Показатели репродукции рекомбинантного штамма X 53-А после омагничивания КЭ

пост. ЭМП ЮООЭ

риодом колебаний 50-60 с в течение 10-35 мин.

Таблица 1

Таблица 2

Таблица 4

Развернутая реакция гемагглютинации с алантоисной жидкостью вируса Х-53-А при определении инфекционныхтитров на КЭ

Примечание. х с - по ведения вируса;

1). 2) и т д. - номера пробирок с алантоисной жидкостью.

Таблица

Репродукция вируса гриппа Д/Яенннград/0139 (Н2Н2) в культуре клеток после обработки ее пост.ЗИП 1000 3, различное ареня

Примечание. )- кратность прироста гемзгглютинмруоцих титров;

хх) - - -- -инфекционных титров, логарифм 3KHfOonta,логарифм ЭИ/ контроля

ТаОлч

Средниг генагглотинирувцие м инфекционные титры вирусов гриппа П/Ленинград/0139йАехас/77 в вируссодераэяей вядкоети клеток flCX, обработанных в взвеси копеЬ ЗИП

ТаОлчцаб

Репродукция вируса гриппа А/Киев/5У7Э в культуре клеток ПСХ, обработанных колеб. ЗИП

Таблица 8

Титры вируса Ф/Техасс/77 после обработки КЭ колеб. ЭМП в дозе 5000 Э

различное время

Примечание. х Кратность прироста ГЕ-титров;

хх Кратность прироста инфекционной активности.

100 Времъс