СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСА ИНГИБИТОРОВ ЛЕЙКОЦИТАРНЫХ ПРОТЕИНАЗ Российский патент 1997 года по МПК C12N9/50 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к процессам биосинтеза и очистки интерферона, и может быть использовано для подавления протеолитической активности при производстве медицинских препаратов белковой природы.

Внедрение ингибиторов сопряжено с рядом трудностей.

В большинстве природных продуктов биотехнологии обнаруживается весьма широкий спектр протеиназ, поэтому наиболее перспективно использование неспецифических ингибиторов. Кроме того, для производства медицинских препаратов могут быть использованы только такие ингибиторы, которые не обладают антигенными или токсическими свойствами.

Известен способ получения ингибитора сывороточных протеиназ- α₂ макроглобулина, включающий в качестве основного этапа очистки двукратное осаждение B-липопротеидов добавлением водного раствора ПЭГ-6000 до конечной концентрации 12,5% хроматографию на смеси (2:1), ультрагель AcA-22 и AcA-34, концентрирование ультрафильтрацией на мембране типа 12133 фирмы "Сарториус", диализ в течение 48 ч, иммуноадсорбцию на CNB- активированной сефарозе-4B, повторную концентрацию и диализ в течение 24 ч (A.J. Barret "Macroglobulin, Methods in Enzymology" v. 80, 1981, p. 737-754).

Известен способ получения ингибитора сывороточных протеиназ- α₁ антихимотрипсина ( α₁ АХТ), включающий в качестве основных этапов: фракционирование плазменных белков сульфатом аммония (до 50% от насыщения), аффинную хроматографию на Cibacron Blue Sepharose в 0,03 М PBS буфере pH 6,8, рехроматографию на Cibacron Blue Sepharose в 0,05 М трис HCl буфером pH 8,0 в присутствии 0,2 М NaCl (J. Travis and M. Morri "Antichymotrypsin, Methods in Enzymology", v. 80, 1981, p. 765-771).

Известен способ получения ингибитора сывороточных протеиназ- α₁ - протеиназный ингибитор антитрипсина или ( α₁ PI), включающий: фракционирование плазменных белков сульфатом аммония при насыщении 0,5-0,8 М, удаление альбуминовой фракции на Cibacron Blue Sepharose в 0,03 М PBS буфере pH 6,7, фракционирование на ДЕАЕ-целлюлозе в линейном градиенте NaCl от 0,2 М NaCl мл в 2000 мл до 0,03 М в PBS pH 6,5 и гельфильтрацию на колонке Сефадекс Г-25 в 0,05 М трис HCl+0,05 М NaCl pH 8,0 (J. Nravis and D. Johnson-Human-Proteinase Inhibitor. Methods in Enzymology", v. 80, 1981, p. 754-765).

Однако этими способами получают один конкретный, гомогенноочищенный ингибитор, в результате чего происходит потеря других, содержащихся в исходном материале.

Ингибиторы, полученные таким образом, малоэффективны для подавления лейкоцитарных протеиназ. Кроме того, процесс получения трудоемок, продолжителен по времени и дорогостоящ.

Целью изобретения является получение комплекса ингибиторов, обладающих высокой эффективностью в отношении лейкоцитарных протеиназ (КИЛП).

Поставленная цель достигается путем обработки плазмы или сыворотки донорской крови 10% хлороформа, осаждением супернатанта 30%-ным водным раствором полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) до конечной концентрации 6% ионообменной и металлхелатной хроматографией с последующим диализом и стерилизующей фильтрацией.

Пример 1. К 250 мл плазмы или сыворотки донорской крови добавляют 10% хлороформа /25 мл) и выдерживают 30 мин при комнатной температуре, постоянно перемешивая. Смеси дают отстояться. После ее расслоения на фракции хлороформа (нижняя) и водную (верхняя), последнюю собирают декантированием и центрифугируют 2000 xg, 30 мин, 4^oC. Осадок отбрасывают, к недостаточной жидкости добавляют 30% -ный водный раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) до конечной концентрации 9% (94 мл). Смесь выдерживают при 4^oC в течение 2 ч, после чего центрифугируют (2000 xg, 30 мин). Осадок отбрасывают, а в надосадочной жидкости доводят pH до 8,0 (добавляя по каплям 20% NaOH под контролем pH-метра). Затем надосадочную жидкость наносят на колонку (2,6х40 см) с ДеАЕ-целлюлозой, предварительно уравновешенную в 0,01 М трис HCl буфере pH 8,0+0,01 М NaCl, со скоростью 30-40 мл/ч. Фракцию, свободно проходящую через колонку, собирают, доводят pH до 6,0 (добавляя по каплям 20% HCl под контролем pH-метра) и наносят со скоростью 30-40 мл/ч на колонку (2,6х20) с хелатирующей сефарозой-6B со скоростью 30 мл/ч, предварительно уравновешенную в 0,02 М фосфатном буферном растворе pH 6,0+0,8 М NaCl и заряженную ионами (Zn⁺⁺) цинка. Насыщение и зарядка сорбента ионами цинка производится бейч методом в стакане. В колоночный объем сорбента, находящийся в минимальном объеме посадочного буфера, добавляют 100 мл водного раствора ZnCl₂ (250 мг ZnCl₂ растворяют в 100 мл H₂O), постоянно помешивая палочкой, в течение 1-2 ч. После зарядки сорбент тщательно промывают посадочным буфером (0,02 М фосфатным буферным раствором + 0,08 М NaCl pH 6,0) на делительной воронке (пропуская 0,5-1,0 л). По окончании посадки (на колонку с хелатирующей сефарозой) колонку промывают исходным посадочным буфером. Элюцию материала, сорбированного на колонке, проводят 0,02 М NaCl/ацетатным) буферным раствором pH 5,0+0,15 М NaCl со скоростью 30 мл/ч. В ходе элюции происходит разделение белков на фракции, соответствующие двум пикам поглощения при 280 нм.

При оценке анти-протеиназной активности полученных фракций по модификации P. M. Starhey, с использованием азоказеина в качестве субстрата, было установлено, что фракция первого пика ингибируют стандарт лейкоцитарных протеиназ (СЛП) на 25-30% а фракция второго пика не обладает такой активностью.

Пример 2. 250 мл донорской плазмы или сыворотки обрабатывают хлороформом также, как и в примере 1. Осадок отбрасывают, а к надосадочной жидкости добавляют 30%-ный водный раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) до конечной концентрации 6% (62,5 мл). Смесь выдерживают при 4^oC в течение ночи, затем центрифугируют при 2000 xg, 30 мин, 4^oC. Осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость наносят на колонку (2,6х40 см) с ДЕАЕ-целлюлозой, предварительно уравновешенную в 0,01 М трис HCl буфере pH 8,0+0,01 М NaCl, со скоростью 30-40 мл/ч. Фракцию, свободно проходящую через колонку, доводят в ней pH до 6,0 (добавляя по каплям 20% HCl под контролем pH-метра) и наносят со скоростью 30-40 мл/ч на колонку (2,6х20) с хелатирующей сефарозой, предварительно уравновешенную в 0,02 М фосфатном буферном растворе pH 6,0+0,8 М NaCl и заряженную ионами цинка. Насыщение и зарядка сорбента ионами цинка производится бейч методом в стакане. В колоночный объем сорбента, находящийся в минимальном объеме посадочного буфера, добавляют 100 мл водного раствора ZnCl₂ (250 мг ZnCl₂ растворяют в 100 мл H₂O), постоянно помешивая палочкой, в течение 1-2 ч. После зарядки сорбент тщательно промывают посадочным буфером (0,02 М фосфатным буферным раствором+0,8 М NaCl pH 6,0) на делительной воронке (пропуская 0,5-1,0 л).

По окончании посадок (на колонку с хелатирующей сефрозой) колонку промывают исходным посадочным буфером. Элюцию материала, сорбированного на колонке, проводят 0,02 М NaCl (ацетатным) буферным раствором pH 5,0+0,5 М NaCl, со скоростью 30 мл/ч. В ходе элюции происходит разделение белков на фракции, соответствующие двум пикам. Ингибирующей активностью обладает только фракция первого пика и составляет 50%
Пример 3. 250 мл плазмы обрабатывают хлороформом и центрифугируют также, как в примерах 1, 2. Осадок отбрасывают, а к надосадочной жидкости добавляют 30%-ный водный раствор ПЭГа до конечной концентрации 6% /62,5 мл/. Смесь выдерживают в течение ночи при 4^oC, после чего центрифугируют (2000 xg, 30 мин, 4^oC). Осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость наносят на колонку с ДЕАЕ-целлюлозой, предварительно уравновешенную в 0,01 М трис HCl буфере pH 9,0+0,01 М NaCl со скоростью 30 мл/ч. Фракцию, проходящую через колонку, собирают, доводят в ней величину pH до 6,8 и наносят на колонку с хелатирующей сефарозой, предварительно уравновешенную в 0,02 М фосфатном буферном растворе pH 6,8+1,0 М NaCl и заряженную ионами меди. По окончании посадки колонку промывают 0,02 М фосфатным раствором pH 6,8+1,0 М NaCl. Элюцию материала проводят 0,02 М NaCl (ацетатным) буферным раствором pH 5,0+0,15 М NaCl со скоростью 30 мл/ч. В ходе элюции происходит разделение белков на фракции, соответствующие двум пикам поглощения при 280 нм.

Фракцию первого пика ингибирует активность стандарта лейкоцитарных протеиназ на 60-70% Фракция второго пика ингибирующей активностью не обладает.

Пример 4. 250 мл донорской плазмы или сыворотки обрабатывают хлороформом и центрифугируют также, как в примерах 1, 2. Осадок отбрасывают, а к надосадочной жидкости добавляют 30%-ный водный раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) до конечной концентрации 6% (62,5 мл). Смесь выдерживают в течение ночи при 4^oC, после чего центрифугируют (2000 xg, 30 мин, 4^oC). Надосадочную жидкость наносят на колонку (2,6х40 см) с ДЕАЕ-целлюлозой, предварительно уравновешенную в 0,01 М трис HCl буфере pH 8,5+0,01 М NaCl со скоростью 30-40 мл/ч. Фракцию, свободно проходящую через колонку, собирают, постепенно доводят в ней величину pH до 6,5 и наносят со скоростью 30 мл/ч на колонку с хелатирующей сефарозой -6B, предварительно уравновешенную в 0,02 М в фосфатном буферном растворе pH 6,5+0,8 М NaCl и заряженную ионами меди Cu⁺⁺. Насыщение и зарядка сорбента ионами меди производится бейч методом в стакане. В колоночный объем сорбента, находящийся в минимальном объеме посадочного буфера, добавляют 100 мл водного раствора CuSO₄ (250 мг CuSO₄ растворяют в 100 мл H₂O), постоянно помешивая стеклянной палочкой, в течение 1-2 ч. После зарядки сорбент тщательно промывают посадочным буфером (0,02 М фосфатным буферным раствором + 0,8 М NaCl pH 6,5) на делительной воронке (пропуская 0,5-1,0 л).

По окончании посадки (на колонку с хелирующей сефарозой) колонку промывают 0,02 М фосфатным буферным раствором pH 7,4+0,8 М NaCl до тех пор, пока кривая на хроматограмме не опустится на базовую линию, определяемую на проточном денситометре при 280 нм.

Элюцию материала, сорбированного на колонке, проводят 0,02 М Na-ацетатным буферным раствором pH 4,5+0,5 М NaCl со скоростью 20 мл/ч. В ходе элюции происходит разделение белков на фракции, соответствующие двум пикам поглощения при 280 нм.

Активность ингибиторов оценивали по способности фракций подавлять стандарт лейкоцитарных протеиназ. Определение проводили по модифицированному методу P.M. Starhey (P.M. Starhey-Proteinases in Mammalian cells and Tussue, Biomedical Press, 1977) с азоказеином в качестве субстрата. Активность стандарта лейкоцитарных протеиназ ингибируется фракцией 1-го пика на 100%
Таким образом, целевой продукт находится в первой фракции. Фракция второго пика не обладает антипротеиназной активностью. Материалы первого пика диализуют против 0,01 М фосфатного буферного раствора pH 7,2+0,5 М NaCl и стерилизуют фильтрацией через мембрану с диаметром пор 0,2 μ км.

Идентификацию ингибиторов, содержащихся в первом пике и проявляющих активность в отношении стандарта лейкоцитарных протеиназ, проводят с помощью электрофореза в 7%-ном ПААГеле+0,1% SDS.

При изучении последовательных серий было установлено (табл. 1), что из 250 мл донорской плазмы удаляется в среднем получить 132±28 мл КИЛП с содержанием белка 6,63±0,72 мг/мл. В концентрации (по белку) 100 мкг/мл достигается полное подавление активности стандарта лейкоцитарных протеиназ. Концентрация КИЛП, необходимая для эффективного подавления протеолиза в конкретных биохимических процессах, устанавливается эмпирически. Так, в процессах иммуноаффинной хроматографии человеческого лейкоцитарного интерферона для инъекций и лейкинферона для инъекций, эффективное подавление протеолиза достигается при концентрации КИЛП 30-50 мкг/мл.

Использование КИЛП в биотехнологии производства медицинских препаратов лейкоцитарного интерферона позволит избежать потерь иммунобиологической активности, связанных с протеолизом.

На стадии иммуноаффинной хроматографии применение КИЛП в указанной концентрации предотвращало загрязнение препарата фрагментами антител, иммобилизованных на колонке для очистки от вируса индуктора (табл. 2).

Основным преимуществом КИЛП, по сравнению с другими ингибиторами протеолиза, является широкий спектр действия, отсутствие антигенности для человека, его не токсичность и возможность организации крупномасштабного производства.

Использование: биотехнология, в частности процессы биосинтеза и очистки интерферона, и может быть использовано для подавления протеолитической активности при производстве медицинских препаратов белковой природы. Сущность изобретения: получение одновременно комплекса ингибиторов лейкоцитарных протеиназ - α₂ макроглобулина, α₁ - антихимотрипсина и α₁ - протеиназный ингибитор антитрипсина. Цель достигается путем обработки плазмы или сыворотки донорской крови хлороформом, осаждением супернатанта водным раствором полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000), ионнообменной и металлхелатной хроматографией с последующим диализом и стерилизующей фильтрацией. 2 табл.

Способ получения комплекса ингибиторов лейкоцитарных протеиназ, включающий добавление к плазме или сыворотке крови хлороформа, перемешивание, отбор водной фракции и ее центрифугирование, добавление к надосадочной жидкости полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000), хроматографию на ДЕАЕ-целлюлозе, предварительно уравновешенной 0,01 М трис HCl буфером при pH 8,0 и 0,01 М NaCl, доведение проходящей фракции до pH 6,0-6,8, цинк и/или медь-хелатную хроматографию, с последующей элюцией ацетатным буфером и диализом против фосфатного буфера.