СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ В ОРГАНИЗМЕ Российский патент 1997 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к медицине и предназначается для определения патологических нарушений гомеостаза, в том числе иммунного, при инфекционных заболеваниях и интоксикациях. Для выявления патологических нарушений в организме используются различные показатели: повышение температуры, определение СОЭ, количественные и качественные характеристики клеток и плазмы крови, мочи и других биологических жидкостей, результаты гистологических исследований биоптатов, определение функциональной активности ферментов и др. Однако эти показатели не всегда информативны и недостаточно чувствительны.

Изменения миграционной активности лейкоцитов являются чувствительной реакцией на различные внешние и внутренние патологические воздействия на организм.

Миграционная активность моноцитов, макрофагов, лейкоцитов исследуется давно. Однако наибольшее внимание уделяется реакции торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ). Согласно общепринятому мнению, она отражает повышение активности клеточного иммунитета. Что же касается альтернативного феномена - стимуляции миграционной активности лейкоцитов (МАЛ), то литература по этому вопросу малочисленна. Предполагают, что стимуляция МАЛ ассоциирует с угнетением клеточного иммунитета, повышением активности супрессорных механизмов. Известно, что многие инфекционные заболевания и стрессорные состояния сопровождаются увеличением клеток-супрессоров и, как следствие, развитием вторичных иммунодефицитов.

Имеются различные варианты определения клеточной миграции in vitro с использованием стеклянных или пластиковых капилляров, монослоя клеток в соскобе, агарозы, агарозных капель или коллагеновых матриксов.

В качестве разрешающих антигенов, как правило, используют ЛПС и другие бактериальные антигены, которые к тому же применяют в относительно больших дозах (мг-мкг), или антигены соматических клеток в зависимости от целей исследований.

При этом определяется антигензависимая гиперчувствительность клеток, тестируемая по их миграционной активности в присутствии этих антигенов.

Шига токсин относится к широко распространенным среди бактерий экзотоксинам, обладающим одновременно многими биологическими активностями - энтеро-, цито- и нейротоксичностью, благодаря своей способности ингибировать синтез белка и процессы дыхания в клетках.

Высказано предположение о каком-то важном общебиологическом значении Шига токсина.

Целью настоящего изобретения являлось определение антигеннеспецифической гиперчувствительности лейкоцитов, тестированной по определению миграционной активности клеток в присутствии Шига токсина.

Известен скрининговый тест клеточной миграции (СТКМ) in vitro, разработанный и предусматривающий получение клеток перитонеального экссудата мышей, стимулированных внутрибрюшинным введением вазелинового масла, отмывание их и суспендирование в концентрации 10-20•10⁶ клеток в мл, помещение в лунки плоскодонного планшета со средой культивирования, содержащей различные концентрации регулирующих миграцию клеток антигенов (супернатанты клеток селезенки, реагирующих на антигены эритроцитов барана, сыворотки интактных мышей и здоровых доноров и др.), с помощью наконечников и специально сконструированного штатива для направленной фиксации наконечников, оседание клеток в течение 1 ч и формирование стандартных клеточных микрокультур, инкубацию планшетов с микрокультурами в CO₂ инкубаторе при 37 ^oC в течение 18-20 ч и учет реакции торможения или стимуляции миграции клеток путем измерения площади образовавшейся микрокультуры по сравнению с контрольной.

Этот способ определения миграционной активности лейкоцитов выбран в качестве ближайшего аналога.

Однако известный способ предусматривает получение клеток из перитонеального экссудата, предварительное стимулирование их за 3-5 дней до постановки опыта, использование больших количеств клеток, использование в качестве разрешающего агента продуктов соматических клеток (лимфокинов), регулирующих миграцию клеток.

Известный способ является близким к описываемому по технической сущности и по достигаемому результату, на основании чего выбран нами в качестве аналога.

Однако он принципиально отличается от предложенного способа тем, что позволяет выявлять в присутствии Шига токсина in vitro антигеннеспецифическую гиперчувствительность лейкоцитов крови, тестируемую по стимуляции их миграционной активности, коррелирующей с патологическими изменениями гомеостаза при инфекционных заболеваниях и интоксикациях.

Это достигается путем использования модифицированного нами СТКМ и добавления в качестве разрешающего агента in vitro Шига токсина в специально подобранных концентрациях. Метод отличается тем, что для реакции берут клетки периферической крови (из орбитальной вены глаза мышей), кровь помещают в специальный раствор для более быстрого осаждения эритроцитов, отмытые лейкоциты разводят культуральной средой до концентрации 2-4•10⁶ клеток в 1 мл и добавляют в лунки с культуральной средой, содержащей Шига токсин в разведениях 1•10^-4 1•10^-10 мг/мл, подобранных в предварительных исследованиях. При оценке реакции повышение индекса миграции лейкоцитов на 20 к контролю (без Шига токсина) считается неблагоприятным показателем нарушений гомеостаза.

1. Постановка реакции и определение оптимальных разрешающих доз Шига токсина.

Кровь мыши из орбитальной вены глаза брали в количестве 0,1-0,2 мл, смешивали от 2-4 мышей в пробирке с гепарином (5 ед/мл), разводили средой 199 (1:1), наслаивали на среду LSM (Lymphocyte Separation Medium (Flow Laboratories) или 10 желатину в соотношении 1:2, оставляли при 37 ^oC в течение 1 ч под углом 45^o. Слой плазмы с лейкоцитами отмывали дважды средой 199 с добавлением 2 мМ L-глютамина, 5-10-ной эмбриональной телячьей сыворотки, 40 мкг/мл гентамицина и 10 мМ буферного раствора Hepes, разводили ею до концентрации 2,0-3,0•10⁶ клеток в мл. Для постановки СТКМ использовали наконечники для микрообъемов (желтые фирмы "Brand" или "Blastomed"), специально сконструированные штативы для направленной фиксации наконечников. Каждую пробу отмытых, как указано выше, лейкоцитов помещали с помощью наконечников в 4 ряда лунок плоскодонных планшетов, заполненных различными разведениями Шига токсина, оставляли при комнатной температуре в течение 1 ч на ровной горизонтальной поверхности, после чего штатив с наконечниками осторожно снимали и планшеты с микрокультурами клеток помещали в CO₂ инкубатор при 37 ^oC на 16-20 ч. Учет результатов оценивали в световом микроскопе МБИ-3 при увеличении окуляра 7^x и объектива 1,6^x.

Индекс миграции (ИМ) определяли по формуле:

где Д_o и Д_к -средний диаметр для 4 опытных и 4 контрольных микрокультур соответственно.

У интактных мышей показатели ИМ лейкоцитов крови в присутствии Шига токсина, взятого в концентрации 10^-2 10^-16 мг/мл, в основном колебались в пределах контрольных цифр (±20 и лишь на самые малые и самые большие дозы токсина наблюдалось торможение миграции до -40
У инфицированных сальмонеллами S.dublin животных на 5 сут после заражения в дозе 2700 микр. клеток (25-50 LD₅₀) кривая миграционной активности носила зависимый от концентрации Шига токсина in vitro характер: при больших концентрациях токсина (10^-2 10^-6 мг/мл) наблюдалось наибольшее ускорение миграции, при дозах (10^-10 10^-16 мг/мл) токсина - постепенное уменьшение показателей стимуляции до незначительных колебаний МАЛ по сравнению с контролем.

Через 11 сут после заражения мышей S.dublin в дозе 250 микр. кл. и дальнейшем размножении сальмонелл в организме мышей показатели стимуляции миграционной активности лейкоцитов крови были еще более высокими и оставались достоверно выше контроля на все испытанные концентрации Шига токсина in vitro (фиг.1).

На основании многих опытов с инфицированием интактных, зараженных, иммунизированных мышей были выбраны три дозы Шига токсина in vitro, которые целесообразно использовать в СТКМ: 10^-4, 10^-6 и 10^-10 мг/мл. Для упрощения методики берут дозу 10^-6 мг/мл. Выявление достоверного (более 20 к контролю) ускорения миграционной активности лейкоцитов хотя бы на одну из этих концентраций Шига токсина in vitro свидетельствует о неблагоприятных изменениях гомеостаза. Учитывали также величину ИМ, свидетельствующую о степени выраженности патологических нарушений в организме.

2. Миграционная активность лейкоцитов крови при различной тяжести и исходах сальмонеллезной инфекции.

Поставлено несколько серий опытов, в которых мыши СВА, интактные и вакцинированные химическими и корпускулярными сальмонеллезными вакцинами, заражались внутрибрюшинно различными дозами (от 170 до 5000 микр. клеток) S.dublin и затем в различные сроки после заражения определяли миграционную активность клеток крови. Наблюдения за животными проводили в течение 15 сут, в течение которых отмечали уровни гибели животных в группе. В зависимости от инфицирования разными дозами сальмонелл животных неиммунных и предварительно иммунизированных различными препаратами и их сочетаниями мы имели возможность исследовать миграционную активность лейкоцитов в группах мышей с различной гибелью животных в каждой.

На фиг.2 представлены суммарные данные нескольких опытов. Гибель животных (% ) в группах представлена по возрастающим показателям. Соответственно каждой группе представлены данные показателей ИМ лейкоцитов в пуле лейкоцитов крови этой группы.

Как видно на фиг. отмечается прямая корреляционная зависимость летальности животных в группах и величин стимуляции миграции: наибольшая гибель соответствовала самым высоким показателям усиления МАЛ У погибающих животных ИМ составляла +83 и более. При этом совсем не наблюдалось показателей торможения МАЛ.

Таким образом, в экспериментальных условиях на мышах была установлена тесная прямая корреляция величины ускорения МАЛ с тяжестью инфекционного процесса, тестируемой по гибели животных в группе. Очевидно, стимуляция МАЛ является показателем опасных не только для здоровья, но и самой жизни нарушений гомеостаза, происходящих в организме инфицированных животных.

3. Миграционная активность лейкоцитов крови при интоксикациях.

Группы мышей линии СВА получили внутрибрюшинно Шига токсин в дозах, соответствующих 10, 5, 2, 0,2, 0,02, 0,002 LD₅₀. Через 3 ч и 3 сут после введения токсина у мышей из орбитальной вены глаза брали кровь, с лейкоцитами которой ставили СТКМ. В качестве разрешающих антигенов in vitro брали Шига токсин и ЛПС шигелл Флекснера 2а.

Установлена дозовая зависимость величины ИМ (фиг.3А). Наибольшие показатели стимуляции МАЛ отмечались при введении смертельных доз токсина (10,0 и 5,0 LD₅₀). Все животные погибли в течение 4-5 сут при явлениях параличей задних конечностей. Достоверное увеличение МАЛ отмечалось также при дозах 2,0 и 0,2 LD₅₀, меньшие дозы Шига токсина ускорения МАЛ не вызывали.

К ЛПС шигелл Флекснера, использованного в качестве разрешающего антигена, достоверного ускорения МАЛ практически не наблюдалось даже при введении летальных доз Шига токсина: на все дозы Шига токсина, введенного мышам, отмечалось торможение МАЛ к ЛПС шигелл Флекснера in vitro (фиг.3А).

Реакция СТКМ в нашей модификации, таким образом, была высоко чувствительным тестом определения интоксикации Шига токсином, позволяя выявить ускорение миграции даже при введении мышам 0,2 LD₅₀ Шига токсина, в отличие от летальной мышиной модели. Опыт показал, что при введении Шига токсина изменения гомеостаза начинаются уже через 3 ч после введения токсина (более ранние сроки не исследовались), отмечаются в течение 7-10 сут, через 14 сут эти изменения не обнаруживаются.

4. Использование способа при интоксикации эндотоксином (ЛПС) шигелл.

Группам мышей СВА вводили внутрибрюшинно ЛПС в дозах 4,0, 2,0, 1,0, 0,1, 0,01, 0,001 мг. Через 3 ч и 2-3 сут брали кровь из орбитальной вены глаза и с лейкоцитами ставили СТКМ в присутствии in vitro ЛПС шигелл Флекснера 2а и Шига токсина в качестве разрешающих антигенов в концентрациях 10^-6 - 10^-16 мг/мл.

Было установлено (фиг. 3Б), что дозы ЛПС 4,0 и 2,0 мг вызывали у мышей достоверное ускорение МАЛ в присутствии in vitro ЛПС. Меньшие дозы ЛПС не вызывали стимуляции МАЛ, отмечалось лишь достоверное торможение миграции.

Наш расчет показал, что дозы 4,0 и 2,0 мг/мышь соответствовали примерно 400 и 200 дозам дизентерийной вакцины для человека, дозы 1,0, 0,1 и 0,01 соответственно 100, 10 и 1-ой человеческим дозам. Одна человеческая доза 500 млн микробных клеток корпускулярной вакцины или 0,01 мг в пересчете на ЛПС - подобрана эмпирически путем подбора толерантных доз на добровольцах. Отсутствие стимуляции МАЛ в присутствии гомологичного ЛПС на дозы 1,0 и 0,1 мг (соответствующих 100 и 10 человеческим дозам) свидетельствует о довольно низкой чувствительности теста при использовании ЛПС.

Предложенный нами способ постановки СТКМ с Шига токсином в качестве разрешающего антигена показал, что он выявляет все дозы ЛПС от 4,0 до 0,1 мг/мышь и не стимулирует миграцию лейкоцитов при введении мышам ЛПС в дозе 0,01 (соответствующей 1-ой человеческой дозе вакцины). Таким образом, предлагаемый нами способ является более чувствительным и информативным, чем СТКМ в присутствии гомологичного антигена.

Следует заметить, что дозы 0,1-0,001 мг/мышь вызывают достоверное торможение миграции лейкоцитов, особенно к гомологичному антигену.

Назначение: медицина, для определения патологических нарушений в организме, в т.ч. иммунного характера, при инфекционных заболеваниях, интоксикациях. Сущность: из пробы крови выделяют лейкоциты, ставят тест клеточной миграции в присутствии Шига-токсина и при уровне стимуляции миграции лейкоцитов более 20 % относительно нормы определяют наличие патологических изменений в организме. 2 з.п. ф-лы, 3 ил.

1. Способ определения патологических нарушений в организме, включающий выделение клеток, постановку теста клеточной миграции in vitro в присутствии регулятора миграции клеток и учет полученных результатов, отличающийся тем, что выделяют лейкоциты из периферической крови, тест миграции лейкоцитов ставят в присутствии Шига-токсина, взятого в концентрации 10^- 4 - 10^- 1 0 мг/мл суспензионной среды, и при уровне стимуляции миграции лейкоцитов выше 20% относительно нормы определяют патологические нарушения в организме. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для постановки теста клеточной миграции берут лейкоциты в концентрации (2 4)•10⁶ клеток/мл суспензионной среды. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что Шига-токсин берут в концентрации 10^- 6 мг/мл суспензионной среды.