ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БИФИДОБАКТЕРИЙ Российский патент 2010 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологической, пищевой промышленности и касается приготовления питательных сред, используемых для культивирования бифидобактерий.

Бифидобактерии являются облигатными анаэробами и отличаются своеобразными питательными потребностями.

Известна питательная среда для культивирования бифидобактерий, включающая органическую, минеральную основу и стимуляторы роста (Патент RU 2080376, МПК C12N 1/20, опубл. 1995):

Железо сернокислое - 0,002-0,1

Натрий хлористый - 4,0-6,0

Глюкоза - 8,0-12,0

Агар-агар - 0,75-1,0

Аскорбиновая кислота - 0,8-1,0

Гидролизат молозивной казеиново-сывороточной массы - до 100%.

Недостатком данной среды является то, что аминный азот такой среды весьма низок 70-110 мг %, поэтому среда обладает слабыми ростовыми свойствами. Кроме того, ввиду труднодоступности питательного сырья (молозивной казеиново-сывороточной массы) данная питательная среда для крупномасштабного культивирования бифидобактерий неперспективна.

Известна также широко распространенная для культивирования бифидобактерий кукурузно-лактозная среда:

Агар-агар - 2,5 г

Пептон - 10 г

Кукурузный экстракт - 40 мл

Натрий лимоннокислый - 6,6 г

Магний сернокислый - 0,12 г

Калий фосфорнокислый двузамещенный - 2,0 г

Лактоза - 10 г

Цистин солянокислый - 0,15 г

Недостатками этой среды являются:

- наличие кукурузного экстракта, который зачастую имеет высокую обсемененность сопутствующими формами бактерий;

- концентрат бифидобактерий, полученный на ее основе, имеет недостаточную сохранность бифидобактерий при хранении;

- содержит дорогостоящие стимулирующие добавки, такие как пептон, цистин солянокислый.

Известна питательная среда для культивирования бифидобактерий следующего состава (ГОСТ 25102-82 или СанПИН 42-123-49-40-88 п.5.2. и 7.2. Гидролизатно-молочная среда):

Пептон - 2,0-2,5

Натрий хлористый - 2,0-3,0

Цистеин (L-цистин) солянокислый - 0,1-0,15

Лактоза-8,0-10,0

Агар-агар - 0,7-0,8

Гидролизат обрата молока - до 1 л

рН среды - 7,2-7,4

Среда такого состава дает хорошие результаты при культивировании бифидобактерий. Однако в качестве основы этой среды используется гидролизат молока и дорогостоящие добавки (пептон, цистеин), что обусловливает высокую стоимость среды.

Наиболее близкой к заявляемому техническому решению является питательная среда для накопления биомассы бифидобактерий, содержащая питательную основу, стимулятор роста (лактозу, цистеин), агар-агар и воду. В качестве питательной основы она содержит молочную сыворотку и дрожжевой автолизат сухой или жидкий, натрий фосфорнокислый однозамещенный двуводный, аммоний хлористый и магний сернокислый семиводный (патент РФ №2087532, МПК C12N 1/20, опубл. 20.08.97), при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Молочная сыворотка осветленная - 7,5-10,0

Дрожжевой автолизат сухой или жидкий - 0,2-3,0

Лактоза - 0,3-0,5

D,L-цистеин - 0,05-0,1

Натрий фосфорнокислый однозамещенный двуводный - 0,7-0,8

Аммоний хлористый - 0,1-0,15

Магний сернокислый семиводный - 0,015-0,02

Агар-агар - 0,075-0,08

Вода - Остальное до 100%

рН среды 7,2-7,4

Среда такого состава ускоряет размножение бифидобактерий. Биомасса с титром

10⁹ Кое/мл нарастает в течение 7-8 часов.

Однако при этом происходит значительное повышение титруемой кислотности концентрата бифидобактерий (до 120°Т), что в свою очередь снижает в дальнейшем их жизнеспособность.

Задачей предлагаемого изобретения является получение относительно дешевой питательной среды, обеспечивающей высокую скорость размножения бифидобактерий с максимальным их ростом, а также длительную сохранность их жизнеспособности при дальнейшем хранении.

Указанная задача достигается тем, что питательная среда для культивирования бифидобактерий, содержащая молочную сыворотку осветленную, агар-агар, воду, согласно изобретению дополнительно содержит полисахаридный продукт из бурых водорослей, полученный путем экстракции измельченных водорослей пищевой кислотой при рН 6-7, заливки раствором гидрокарбоната натрия до рН 8-9, нагревания в течение 2-3 ч до 80-95°С при периодическом перемешивании, гомогенизации полученной вязкой массы, нейтрализации до рН 6,0-6,5, пастеризации и при необходимости сушки, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

молочная сыворотка 7,5-10,0 полисахаридный продукт из бурых водорослей жидкий 5,0-10,0 или сухой 0,2-0,4 агар-агар 0,075-0,08 дистиллированная вода остальное.

Введение в питательную среду полисахаридного продукта, полученного из бурых водорослей, обеспечивает обогащение ее необходимыми аминокислотами (глутаминовая, аспарагиновая, цистеин и другие), минеральными элементами (главным образом, натрий, а также калий, магний, железо и др.), витаминами, полиненасыщенными жирными кислотами, а также смесью высокомолекулярных полисахаридов. Последние ускоряют развитие бифидобактерий, повышая выход их биомассы, тормозят рост патогенных бактерий. Кроме того, полисахаридный продукт стабилизирует условия развития бактерий, сдерживает повышение титруемой кислотности среды, что увеличивает жизнеспособность бифидобактерий, а следовательно, и сроки хранения концентрата бифидобактерий как в жидкой, так и сухой форме без потери активности. Наличие молочной сыворотки обеспечивает питательную среду необходимым количеством органического азота. Предлагаемая молочно-полисахаридная среда обладает высокими ростовыми качествами с получением в течение 6-8 ч биомассы бифидобактерий до концентрации 10¹¹-10¹² КОЕ/мл и сохранением титруемой кислотности 70°Т до 70 суток.

Данное изобретение соответствует критериям «Новизна», «Изобретательский уровень» и «Промышленное применение»

Новым в данном изобретении является то, что в питательную среду дополнительно вносят полисахаридный продукт из бурых водорослей.

Полисахаридный продукт из бурых водорослей получают следующим образом. Водоросль-сырец или восстановленную (после замачивания сушеной водоросли в питьевой воде в течение 3-8 ч) измельчают на фарш-волчке и проводят кислотную обработку. Для этого измельченные водоросли заливают раствором пищевой кислоты (до рН 1-3) на 2-3 ч. Затем водоросли промывают пресной водой 2-3 раза с настаиванием по 20-30 мин до рН 6-7. Промытые водоросли заливают раствором NaHCO₃ (V:V-1:1) до рН 8-9 и нагревают в течение 2-3 ч при 80-95°С при периодическом перемешивании. Полученную вязкую массу гомогенизируют и нейтрализуют пищевой кислотой до рН 6,0-6,5. Гомогенную массу пастеризуют при температуре 80-90°С, фасуют и укупоривают.

Химический состав полисахаридного продукта из бурых водорослей отражен в таблице № 1.

Таблица 1 Продукт Минеральные вещ-ва Альгиновая кислота Маннит Клетчатка Белок Йод Полисахаридный продукт из бурых водорослей 33,3 47,3 3,8 6,4 6,8 0,01

Питательная среда готовится следующим образом. В небольшом количестве дистиллированной воды расплавляют агар в количестве 0,075-0,008 г. К остальному количеству дистиллированной воды (до общего объема 100 г) добавляют 5-10 г полисахаридного продукта из бурых водорослей и 7,5-10 г осветленной молочной сыворотки. Смесь нагревают до температуры 80-90°С, соединяют с расплавленным агаром, разливают во флаконы и стерилизуют при температуре 112±1°С в течение 15±1 мин, активная кислотность готовой среды 7,1±0,1 ед. рН. Полученную питательную среду можно сушить сублимационной или лиофильной сушкой.

Ниже приведены данные по культивированию бифидобактерий с использованием заявляемой питательной среды и среды-прототипа.

Таблица 2 Питательная
среда Время
культивирования,
ч Титр,
КОЕ/мл Кислотность,
°Т Срок
хранения, сут Среда- 7-8 10⁹ 120 до 30 прототип         Заявляемая 6-8 10^11-10¹² 65-70 до 70 среда        

Посевную дозу культуры бифидобактерий вносят в количестве 3-5% от объема питательной среды, а культивирование осуществляют в течение 6-8 часов. Это достаточно для получения концентрата бифидобактерий с титром не менее 10^11-10¹² КОЕ/мл.

Из представленной таблицы №2 видно, что титр бифидобактерий после культивирования в заявляемой питательной среде на 2-3 порядка выше, чем в среде-прототипе, а титруемая кислотность, соответственно, ниже.

Питательная среда содержит, мас.%: молочную сыворотку осветленную - 7,5-10,0, агар-агар - 0,075-0,08, полисахаридный продукт из бурых водорослей жидкий или сухой соответственно - 5,0-10,0 или 0,2-0,4 и дистиллированную воду - остальное. Полисахаридный продукт из бурых водорослей получен путем экстракции измельченных водорослей пищевой кислотой при рН 6-7, заливки раствором гидрокарбоната натрия до рН 8-9, нагревания в течение 2-3 ч до 80-95°С при периодическом перемешивании, гомогенизации полученной вязкой массы, нейтрализации до рН 6,0-6,5, пастеризации и при необходимости сушки. Это обеспечивает высокую скорость размножения бифидобактерий с максимальным их ростом, а также длительную сохранность их жизнедеятельности при дальнейшем хранении. 2 табл.

Питательная среда для культивирования бифидобактерий, содержащая молочную сыворотку осветленную, агар-агар и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит жидкий или сухой полисахаридный продукт из бурых водорослей, полученный путем экстракции измельченных водорослей пищевой кислотой при рН 6-7, заливки раствором гидрокарбоната натрия до рН 8-9, нагревания в течение 2-3 ч до 80-95°С при периодическом перемешивании, гомогенизации полученной вязкой массы, нейтрализации до рН 6,0-6,5, пастеризации и при необходимости сушки, при следующем соотношении компонентов, мас.%:
молочная сыворотка 7,5-10,0 полисахаридный продукт из бурых водорослей жидкий 5,0-10,0 или сухой 0,2-0,4 агар-агар 0,075-0,08 дистиллированная вода остальное