Способ культивирования бифидобактерий Российский патент 2018 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 C12R1/01 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению биомассы пробиотических микроорганизмов.

Известно, что молочнокислые микроорганизмы играют важную роль в жизни человека, являются одной из наиболее важных составляющих микрофлоры кишечника взрослых и детей и выполняют ряд полезных для организма функций, оказывают положительное влияние на структуру слизистой оболочки кишечника и ее абсорбирующую способность. Бифидобактерии широко используются для поддержания в активном состоянии микрофлоры желудочно-кишечного тракта новорожденных, детей младшего возраста и могут быть использованы для поддержания здоровья всех возрастных групп. Кисломолочные продукты, получаемые с использованием заквасок на основе бифидобактерий, а также биопрепараты, содержащие лиофильно высушенные клетки бифидобактерий, обладают выраженной антагонистической активностью в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов и повышают иммунореактивность организма человека в целом. Молочнокислые продукты, вырабатываемые с использованием молочнокислых микроорганизмов, в том числе, бифидобактерий, считаются особо ценными для здоровья человека.

При получении жидких концентратов бифидобактерий (при содержании не менее 10¹⁰ КОЕ/см³), молочнокислых пищевых продуктов большое внимание уделяется качеству и составу питательных сред, на которых выращиваются бифидобактерии. Важным является повышение уровня биохимической активности бифидобактерий и высокие потребительские качества получаемого продукта.

Известен способ культивирований бифидобактерий (Bifidobacterium bifidum) для получения концентрата на среде, содержащей панкреатический гидролизат молока (7-9%), Д (-) лактозу (0,05-0,15%), цистин солянокислый (0,001-0,007), автолизат пекарских дрожжей (0,5-2,0%), аскорбиновую кислоту (0,003-0,009%)), а в качестве основы питательной среды стерильное молоко (RU 2104706 С1, 1998). Недостатком данного способа является сложный состав питательной среды, большой расход высококачественного сухого молока. Высокое содержание белка в питательной среде приводит к риску контаминации продукта и нестабильности и неоднородности биомассы бактерий в процессе высушивания (при получении сухого концентрата бифидобактерий).

Известен способ культивирования бифидобактерий на питательной среде для получения жидкого концентрата бифидобактерий на основе штаммов Bifidobacterium bifidum 8-3, Bifidobacterium longum Я3, Bifidobacterium adolescentis B1 с использованием питательной среды, включающей, мас. %: лактопептон (5,0-7,0), цистеин солянокислый (0,001-0,005), дрожжевой автолизат (2,0-4,0), обрат молока (основа) - остальное (RU 2326940 С1, 2008).

Однако описанная питательная среда малопригодна для стабилизации процесса культивирования бактерий из-за несбалансированности по минеральному составу (отсутствуют минеральные компоненты). Как показали эксперименты, в результате снижается биохимический потенциал клеток и их жизнеспособность. Немаловажным фактором является также высокая стоимость питательных сред на основе компонентов, являющихся пищевым сырьем.

Известно, что по потребности в питательных веществах молочнокислые бактерии, в том числе и бифидобактерии относятся к наиболее требовательным микроорганизмам. Особую роль играют сложные органические азотсодержащие соединения. Необходимо использовать специально подобранные смеси белков и аминокислот, причем потребность в наборе и количестве отдельных аминокислот у разных микроорганизмов варьирует. Поэтому подбор компонентного состава питательной среды является важным фактором получения в результате культивирования активной культуры.

Задачей изобретения является создание способа культивирования бифидобактерий с целью получения концентрата активных клеток с сохранением высокой пробиотической способности бифидобактерий.

Техническим результатом изобретения является получение целевого продукта - биомассы бифидобактерий с высокой биохимической активностью и жизнеспособностью.

Этот результат достигается за счет сбалансированности компонентного состава питательной среды, используемой в заявленном способе. Большинству молочнокислых микроорганизмов, в том числе и бифидобактериям, необходимы не только азотистые соединения, но и витамины. Поэтому целесообразно использовать экстракты, гидролизаты и иные добавки из растительного сырья, богатые полноценным белком и витаминами. В заявленном способе предлагается использовать гидролизат гороха как источник белка и аминокислот и различных особо ценных питательных компонентов (рибофлавин, тиамин, фолиевая кислота и др.) с содержанием аминного азота 160-180 мг %.

Используемая в способе питательная среда содержит еще один растительный компонент, богатый азотистыми соединениями и биологически активными веществами - отвар листьев и стеблей люцерны. Данное растение, издавна известное как лекарственное, содержит огромное количество активных органических соединений (жирные органические кислоты, эфирные масла, сапонины, аминокислоты, витамины К, Е, группы В, Д2, микро- и макроэлементы, пантотеновая кислота и т.п.). В отварах и настоях люцерны сохраняются практически все полезные компоненты, которые могут быть использованы микроорганизмами.

Указанный технический результат обеспечивается описываемым способом культивирования бифидобактерий на среде, содержащей источники углерода, азота, фосфора и минеральных элементов, с последующим отделением суспензии бифидобактерий, причем используют питательную среду следующего состава, мас. %:

гидролизат гороха с содержанием аминного азота 160-180 мг % 10 отвар листьев и стеблей люцерны 5 кукурузный экстракт 5 Д(-)-лактоза 0,02-0,05 натрий фосфорнокислый однозамещенный 0,1-0,15 сульфат железа семиводный 0,015-0,017 цистеин 0,005-0,007 осветленная творожная сыворотка остальное

Способ осуществляют следующим образом.

Согласно изобретению, для получения биомассы бифидобактерий проводят их культивирование на питательной среде вышеуказанного состава.

Для приготовления среды приготавливают все компоненты. В жидкую часть среды, включающую гидролизат гороха и отвар листьев и стеблей люцерны в указанных количествах, вносят соли, Д(-)-лактозу, цистеин и кукурузный экстракт, добавляют в качестве основы осветленную творожную сыворотку (до 100%). Эти компоненты обеспечивают потребности бифидобактерий в источниках углерода и азота и минеральных элементах (натрии, фосфоре, железе). Кроме того, среда содержит гидролизаты белков (гидролизат гороха), содержащих смесь аминокислот, белков и фрагментов белков.

Готовую среду стерилизуют, охлаждают до 37°С. Вносят инокулят бифидокультуры в количестве 5-7% и проводят процесс культивирования в течение 22-25 часов. По окончании процесса отделяют верхний слой бактериальной суспензии, остаток (нижние слои) сливают и расфасовывают, проверяя на качество готовый продукт.

Пример

Для приготовления питательной среды осветленную творожную сыворотку раскисляют до рН 6,8-7,2. Готовят отвар листьев и стеблей люцерны из расчета 100 г на 1 л воды, смесь доводят до кипения и прекращают кипячение, охлаждают и процеживают. Гидролизат гороха, доведенный водой до содержания аминного азота 160 мг % (10%) объединяют с отваром листьев и стеблей люцерны (5%), вносят соли: натрий фосфорнокислый однозамещенный (0,15%), сульфат железа семиводный (0,016%), лактозу (0,04%), цистеин (0,005%), добавляют кукурузный экстракт (5%) и доводят до полного объема (до 100%) осветленной творожной сывороткой. Устанавливают рН среды 7,0. Среду стерилизуют при 120-121°С, охлаждают до 37±1°С. Вносят инокулят бифидокультуры Bifidobacterium bifidum 1 в количестве 5%. Наращивание биомассы проводят в течение 24 часов. По окончании процесса культивирования бактериальную суспензию после слива верхнего слоя культуральной жидкости разливают в подготовленные стерильные флаконы и укупоривают.

В результате культивирования бифидобактерий получены концентраты с содержанием клеток не менее 10¹⁰ КОЕ/мл, что подтверждает возможность использования питательной среды вышеуказанного состава и обеспечения на ней оптимальной скорости роста и активности бифидобактерий.

Определяли скорость прироста клеток бифидобактерий по способу-прототипу и заявленному способу. О скорости роста судили по оптической плотности (OD) суспензии клеток через 4, 10 и 20 часов с начала культивирования. OD суспензии бифидобактерий заявляемого способа при λ=540 нм составляла соответственно 3,384, 3,560 и 3,988. OD суспензии бифидобактерий известного способа в тех же условиях составила соответственно 3,215, 3,399 и 3,450.

Кислотность концентрата бифидобактерий согласно заявляемому способу составляет 100°Т, что несколько превышает кислотность концентрата бифидобактерий по известному способу (65-70°Т). Активность сквашивания в обоих случаях составляла 12 ч. Срок хранения концентрата бифидобактерий, полученного заявляемым способом, составил 32-35 суток, срок хранения концентрата, полученного известным способом, 30 суток.

Таким образом, предлагаемый способ культивирования бифидобактерий обеспечивает более высокое качество получаемого концентрата бифидобактерий - повышенные сроки хранения, высокую жизнеспособность клеток бифидобактерий в сочетании с высокой скоростью роста.

Изобретение относится к биотехнологии. Способ культивирования бифидобактерий предусматривает внесение бифидобактерий в питательную среду, содержащую гидролизат гороха с содержанием аминного азота 160-180 мг, отвар листьев и стеблей люцерны, кукурузный экстракт, Д(-)-лактозу, натрий фосфорнокислый однозамещенный, сульфат железа семиводный, цистеин и осветленную творожную сыворотку в заданном соотношении компонентов и проводят наращивание биомассы бифидобактерий в течение 24 часов. Изобретение позволяет повысить сроки хранения и получать биомассу бифидобактерий высокого качества, с более высокой скоростью роста и повышенной жизнеспособностью. 1 пр.

Способ культивирования бифидобактерий на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, фосфора и минеральных элементов в условиях аэрации, с последующим отделением суспензии бифидобактерий, отличающийся тем, что культивирование ведут на питательной среде следующего состава, мас.%:

гидролизат гороха с содержанием аминного азота 160-180 мг% 10 отвар листьев и стеблей люцерны 5 кукурузный экстракт 5 Д (-)-лактоза 0,02-0,05 натрий фосфорнокислый однозамещенный 0,1-0,15 сульфат железа семиводный 0,015-0,017 цистеин 0,005-0,007 осветленная творожная сыворотка остальное