СПОСОБ ЭКСПРЕСС-ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕСТЕРИЛЬНОСТИ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ, КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ И ВИРУСОВ В БИОРЕАКТОРАХ Российский патент 2007 года по МПК C12Q1/22 C12M1/34 C12M1/36 C12N1/10 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в научно-исследовательских работах и при производстве биопрепаратов (вакцин, диагностикумов и других биологически активных веществ) методом глубинного культивирования.

Известны микробиологические способы определения нестерильности питательных сред для культивирования микроорганизмов, клеток животных и вирусов посредствам высева пробы на мясо-пептонный бульон (МПБ), мясо-пептонный агар (МПА) или агар Сабуро, затем оставляют несколько контрольных флаконов со средой сначала при 37°С на 3-4 суток, а затем при комнатной температуре на 10-12 суток (Справочник "Ветеринарные препараты" под ред. Д.Ф.Осидзе. - М: Колос, 1981 - С.47.) - прототип.

Однако указанный способ являются длительными и не позволяют оперативно (1 час) дать качественную оценку стерильности питательной среды, используемой при приготовлении посевного материала (при инокулировании) и для культивирования в биореакторах.

Известно, что реакции метаболизма микроорганизмов и клеток животных являются реакциями окислительно-восстановительного типа, для которых характерен перенос электронов от восстановителя к окислителю. Каждая питательная среда для глубинного культивирования микроорганизмов и клеток животных, в зависимости от ее состава, имеет определенное исходное постоянное значение окислительно-восстановительного потенциала (еН) в диапазоне от -1200 до +1200 мв, которое может быть измерено с помощью окислительно-восстановительного электрода. Электрод по своей конструкции подобен электроду для измерения концентрации водородных ионов (рН), за исключением того, что его чувствительный элемент выполнен из металла (платина, золото или серебро) или стекла с электронной проводимостью. Электродом сравнения, как и при измерении рН, является хлорсеребряный электрод.

Целью изобретения являются разработка качественного способа экспресс-определения нестерильности питательных сред для глубинного культивирования микроорганизмов, клеток животных и вирусов при изготовлении или передаче питательных сред в инокулятор и биореактор в течение 1 часа перед засевом культурой.

Указанная цель достигается тем, что определение нестерильности питательных сред проводят по изменению значения окислительно-восстановительного потенциала (еН) от установившегося в течение 1 часа постоянного значения еН для используемой питательной среды перед процессами инокулирования и культивирования микроорганизмов, клеток животных и вирусов, что приводит к снижению себестоимости производства биопрепаратов за счет исключения нестерильных операций процессов глубинного культивирования.

Способ осуществляют следующим образом. Инокуляторы и биореакторы для глубинного культивирования микроорганизмов, клеток животных и вирусов должны быть снабжены техническими средствами контроля окислительно-восстановительного потенциала (еН), включающими электрод еН и микропроцессорный аналитический блок контроля и регулирования рН и еН. Простерилизованную питательную среду (термическая или фильтрующая стерилизация) передают в предварительно простерилизованный инокулятор или биореактор и производят измерение значения еН данной среды (в мв) при перемешивании.

Если в течение 1 часа не наблюдается изменение значения еН от установившегося значения, то можно с вероятностью Р=0,9 утверждать, что питательная среда стерильна, а отклонение значения еН от установившегося значения в пределах более 10% свидетельствует о контаминировании посторонней микрофлорой питательной среды, которая подлежит повторной стерилизации, во избежание нестерильности при приготовлении инокулята и культивировании.

В качестве контроля берут не менее 8 флаконов или пробирок (статистически значимая выборка) с простерилизованной средой из инокулятора и биореактора, которые высевают на мясо-пептонный агар и оставляют на 3-4 дня в термостате при 37±0,5°С и затем проводят визуальный или микроскопический анализ на пророст контаминирующей культуры, что должно подтверждать экспресс-анализ наличия нестерильности по изменению еН от исходного начального значения для данной питательной среды

Пример 1. Для культивирования вакцинного штамма Brucella abortus 19 в биореакторах при производстве противобруцеллезной вакцины используют питательную среду на основе перевара Хоттингера.

Готовую питательную среду стерилизуют в биореакторе при температуре 127±1°С и давлении 0,08-0,09 МПа в течение 40 мин и затем охлаждают до температуры культивирования (37±0,5°С). Для биологического контроля пробы готовой питательной среды высевают на МПА или МПБ и инкубируют при 37-38°С в течение 3-4 суток.

Установившиеся значения окислительно-восстановительного потенциала данной питательной среды должны находиться в диапазоне от +300 до +400 мв с точностью ±10%. При наличии контаминации посторонней микрофлорой в течение 1 часа отклонение от установившегося значения составляет не менее ±50+60 мв. В контрольных пробах в случае нестерильности по отклонению значения еН обнаружены и микроскопически были индефицированы культуры Escerichia coli и Pseudomonas aeuruginosa в количестве 50/КОЕ в 1 мл. Результаты определения нестерильности питательных сред для культивирования Brucella abortus 19 при производстве вакцины против бруцеллеза КРС приведены в таблице 1.

Таблица 1Результаты экспресс-определения стерильности питательной среды для глубинного культивирования Brucella abortus шт.19 в биореакторе№ n/nТип и емкость биореактораПитательная средаСтерилизация питательной средыНачальное значение еН среды при 37°С (мв)Значение еН через 1 час (мв)Наличие посторонней микрофлоры в контроле через 4 суток1Биор-0,1 (100 л) г.Кириши РФНа основе перевара Хоттингера с добавкамиВ биореакторе при (127±1°С) в течение 10 мин+350±10%+280±10%Escerichia coliu Pseudomonas aeuruginosa 50 КОЕ в 1 мл2Bioflo-6000 (180 л) "NBS" США"-"В биореакторе при 127±1°С в течение 40 мин+400±10%+396±10%Отсутствует

Из таблицы 1 видно, что недостататочная стерилизация питательной среды в биореакторе БИОР-01 привела к возникновению нестерильности, о чем свидетельствовало изменение начального значения еН питательной среды в биореакторе без аэрации при перемешивании в течение одного часа от +350 до +280 мв. Это подтвердили 8 контрольных проб на 4 сутки (контаминация питательной среды культурами Escerichia coli и Pseudomonas aeuruginosa). Стерильность в биореакторе Bioflo-6000 подтвердилась тем, что значение еН питательной среды не изменилась в течение часа в пределах точности измеренения еН (±10%). То же подтвердили и контрольные высевы на МПА или МПБ.

Пример 2. Серьезной проблемой является очистка воздуха, подаваемого в биореакторы на аэрацию, от взвешенных в нем аэрозольных твердых и жидких частиц и, особенно, от микроорганизмов. В 1 м³ воздуха содержится до 10⁴ микроорганизмов. В биореакторы для аэрации культуральной среды подается от 1 до 10 объемов воздуха на объем среды в час (для культур клеток животных при поверхностной аэрации) до 120 об/об·ч^-1 (для микроорганизмов при барботажной аэрации в биореакторах с мешалкой). Цикл культивирования длится от 4 до 200 ч (бактерии и грибы) и до 360 ч (клетки животных и высших растений). Воздух на входе в биореактор и инокулятор должен быть стерильным. Необходимая степень очистки воздуха, поступающего на аэрацию после фильтра тонкой очистки (индивидуальный фильтр), должна составлять 99,9999999%. Результаты определения стерильности питательных сред для культивирования Pasteurella multocida шт. А-1231 при производстве вакцины против пастереллеза свиней, при недостаточной очистке и стерилизации воздуха подаваемого на аэрацию в биореактор, приведены в таблице 2.

Питательную среду готовили на основе гидролизата мяса. Полученную питательную среду стерилизовали в биореакторе при температуре 127±1°С и давлении 0,08-0,09 МПа в течение 40 мин. Из таблицы 2 видно, что недостаточная очистка воздуха, поступающего на аэрацию в биореактор АК-210, вызванная отсутствием индивидуального воздушного фильтра, при воздействии на питательную среду в течение 30 минут приводит к ее контаминации посторонней микрофлорой, о чем свидетельствует изменение еН +240 до +160 ±10% мв в течение часа при интенсивном перемешивании, что подтвердили и контрольные пробы на 4-е сутки выдержки.

Таблица 2Результаты экспресс-определения стерильности питательной среды для глубинного культивирования Pasteurella multocida шт. А-1231№ n/ nТип и емкость биореактораПитательная средаСтерилизация питательной средыСтерилизация воздуха на аэрациюНачальное, значение еН среды при 37°С (мв)Значение еН через 1 часНаличие посторонней микрофлоры в контроле через 4 суток1Биор-0,2 (250 л) г.Кириши РФНа основе гидролизата мяса с добавкамиВ биореакторе при 127°С в течение 40 минИндивидуальный мембранный титановый фильтр+200±10%+195±10%Отсутствует2АК-210 (10 л) Ин-т биологического приборостроения г.Пущино на Оке"-"В биореакторе и в автоклаве при 127°С в течение 40минАэрация питательной среды в течении 30 мин при снятом индивидуальном фильтре+240±10%+160±10%Eserichia coli Вас. megaterium Вас. stearother mophilis. 70 КОЕ в мл

Пример 3. Для глубинного культивирования в суспензии перевиваемых клеток почек сирийского хомячка (ВНК-21) при производстве противоящурной вакцины использовалась стандартная синтетическая минимальная среда Игла. Мембранную стерилизующую фильтрацию синтетической питательной среды при подаче в биореактор осуществляли на фильтрационной установке УПБ с использованием мембран "Millipor" или "Владипор" с размерами пор от 0,2 до 0,3 мкм. Результаты определения стерильности синтетической питательной среды для культивирования клеток животных приведены в таблице 3.

Из таблицы 3 следует, что прокол или разрыв стерилизующей и фильтрующей мембраны приводит к контаминации питательной среды, о чем свидетельствуют и контрольные микробиологические пробы.

Таблица 3Результаты экспресс-определения стерильности синтетической среды для культивирования клеток ВНК-21 при производстве противоящурной вакцины№ n/nТип и емкость биореактораПитательная средаСтерилизация питательной средыНачальное значение еН среды при 37°С (мв)Значение еН через 1 часНаличие посторонней микрофлоры в контроле1Celly-Gen (5 л) "NBS" СШАМинимальная среда ИглаСтерилизующая фильтрация на фильтрационной установке с мембранными фильтрами "Millipor" или "Владипор"-50±10%-49±10%Отсутствует2ВВ (3,5 л) "Belico Biotechnology" США"-"Прокол мембраны-50±10%+15±10%Eserichia coli Вас. subtilis 50 КОЕ в мл

Пример 4. Для глубинного культивирования первичных клеток перепелиных эмбрионов на микроносителях "Цитодекс-3" (псевдосуспензия) при производстве вирусвакцины против болезни Марека кур использовалась синтетическая среда 199, которая стерилизовалась через мембранные фильтры "Миллипор", а микроносители стерилизовались в автоклаве вместе с биореактором, заполненным дистиллированной водой. В случае, когда микроносители только ополаскивались дистиллированной водой, но не стерилизовались и помещались в питательную среду, наблюдалось изменение значения еН в течение 1 часа от +135 до +160±10% мв, что свидетельствует о контаминации питательной среды. То же было подтверждено и в микробиологическом контроле (см. табл.4).

Таблица 4Результаты экспресс-определения стерильности синтетической питательной среды для культивирования первичных клеток перепелиных эмбрионов на микроносителях при производстве вирусвакцины против болезни Марека кур№ n/nТип и емкость биореактораПита-тельная средаМикро-носительСтерилизация питательной средыСтерилизация воздуха на аэрациюНачальное значение еН среды при 37°С (мв)Значение еН через 1 часНаличие посторонней микрофлоры в контроле через 4 суток1Bioflo 111 (3,3 л) "NBS" СШАСреда 199Cytodex-3Стерилизующая фильтрация с использованием мембран "Millipor"Совместно с биореактором, заполненным дистилиро-ванной водой в автоклаве при Т=127°С±1 в течение 30 мин+120±10%+125±10%Отсутствует2"-""-""-""-"Микроносители не стерилизо-вались+135±10%+160±10%Eserich ia coli Вас. megaterium 150 КОЕ в мл

Таким образом, с помощью контроля изменения исходного значения окислительно-восстановительного потенциала подтверждена возможность экспресс-определения нестерильности питательных сред, используемых для культивирования микроорганизмов, клеток животных и вирусов во всех случаях их возможной контаминации посторонней микрофлорой.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в производстве биопрепаратов. Способ предусматривает подачу простерилизованной питательной среды в предварительно простерилизованный инокуляр или биореактор, снабженный техническими средствами контроля окислительно-восстановительного потенциала (еН), включающими электрод еН и микропроцессорный аналитический блок контроля и регулирования еН и рН. Измерение значений окислительно-восстановительного потенциала питательной среды при перемешивании в течение 1 часа и сравнение установившихся значений еН с уровнем установившихся значений. Вывод о нестерильности питательной среды, который делают при отклонении значения окислительно-восстановительного потенциала от установившегося значения окислительно-восстановительного потенциала питательной среды - более 10%. Изобретение позволяет исключить из процесса нестерильные стадии производства биопрепаратов. Снизить себестоимость производства. 4 табл.

Способ экспресс-определения нестерильности питательных сред для глубинного культивирования микроорганизмов, клеток животных и вирусов в биореакторах, предусматривающий подачу простерилизованной питательной среды в предварительно простерилизованный инокулятор или биореактор, снабженный техническими средствами контроля окислительно-восстановительного потенциала (еН), включающими электрод еН и микропроцессорный аналитический блок контроля и регулирования еН и рН, измерения значений окислительно-восстановительного потенциала питательной среды при перемешивании в течение 1 часа, и сравнение значений еН с уровнем установившихся значений, а вывод о нестерильности питательной среды делают при отклонении значения окислительно-восстановительного потенциала от установившегося значения окислительно-восстановительного потенциала питательной среды более чем на 10%.