СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ РЕЗИДЕНТНОЙ И ТРАНЗИТОРНОЙ СТАФИЛОКОККОВОЙ МИКРОФЛОРЫ ПРИ БАКТЕРИОНОСИТЕЛЬСТВЕ Российский патент 1997 года по МПК C12Q1/04 C12N1/20 C12Q1/14 C12Q1/04 C12R1/44 

Изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к способам дифференциальной диагностики микроорганизмов по их потенциальной опасности при инфекционном процессе. В частности, способ предназначен для проведения дифференциальной диагностики между стафилококками, способными вызвать формирование резидентного (постоянного) бактерионосительства на слизистой оболочке верхних дыхательных путей, и микроорганизмами того же вида, но относительно быстро элиминирующимися из организма носителя и тем самым являющимися транзиторными (временными). Необходимость проведения дифференциальной диагностики возникает при отборе контингента из числа персонала лечебно-профилактических учреждений для их последующей санации, а также при выполнении санитарно-гигиенических и экологических исследований. Таким образом, способ предназначен для использования в бактериологических лабораториях акушерских и хирургических стационаров, санитарно-эпидемиологических станций и специализированных научно-исследовательских институтов, разрабатывающих вопросы экологии микроорганизмов.

Вопрос дифференциации резидентной и транзиторной стафилококковой микрофлоры традиционно решается путем проведения многократных (с интервалом 10-20 дней) бактериологических анализов отделяемого слизистой оболочки носовых ходов с выделением чистых культур стафилококков, определения их видовой принадлежности и доказательства идентичности штаммов, полученных от одного человека в течение длительного периода времени на основе сходства спектров их чувствительности к диагностическим бактериофагам и устойчивости к антибиотикам (Г. Н. Чистович. Эпидемиология и профилактика стафилококковых инфекций. Л. Медицина, 1969, с.21,126). Данный подход является наиболее достоверным и может выступать в качестве критерия точности при оценке других методов дифференциации резидентного и транзиторного стафилококкового бактерионосительства. Однако значительная длительность осуществления подобного способа, высокая трудоемкость, большое количество необходимых питательных сред и расходуемых материалов делают его применение крайне затруднительным.

В этой связи пути дальнейшего совершенствования метода дифференциации связаны с качественно иным подходом и основаны на предположении о существовании особых свойств "резидентной" стафилококковой микрофлоры, позволяющих ей закрепляться и длительно персистировать на слизистой оболочке носовых ходов, формируя тем самым состояние длительного (злостного) бактерионосительства. В то же время стафилококки, не обладающие данными свойствами, оказываются неспособными к длительному переживанию и быстро элиминируются защитными механизмами организма носителя. Обнаружение подобных качественных особенностей у стафилококков, выделяемых со слизистой оболочки носовых ходов, делает возможным проведение дифференциации резидентной и транзиторной микрофлоры по результатам однократного бактериологического анализа, что позволяет резко сократить сроки исследования и достичь экономии питательных сред и рабочего времени.

Наиболее перспективным в этом плане является определение свойств стафилококковой микрофлоры, направленных против механизмов противоинфекционной защиты и тем самым обеспечивающих возможность их длительного переживания в организме носителя. Так наличие у микроорганизмов способности к инактивации одного из факторов естественной противоинфекционной резистентности лизоцима, определяемой авторами как антилизоцимная активность (О.Л.Чернова. Антилизоцимная активность стафилококков при бактерионосительстве// Персистенция микроорганизмов. Куйбышев: Куйбышевский мед.ин-т. 1987, с.22-30), и присущей в основном резидентным штаммам стафилококка, позволяет дифференцировать их от транзиторных штаммов того же вида, выделяемых со слизистой оболочки носовых ходов бактерионосителей. Однако лизоцим не проявляет бактерицидного или бактериостатического действия в отношении стафилококков и тем самым не является главным фактором в процессе их элиминации из организма носителя. Соответственно антилизоцимная активность стафилококков не обладает свойствами ведущего признака, определяющего специфическое качество "резидентных" штаммов. В этом плане основной причиной, препятствующей получению необходимого результата, является низкая частота регистрации данного признака (особенно среди представителей вида золотистого стафилококка), что оставляет подавляющее количество анализируемых штаммов (до 70-90%) в зоне "диагностической неопределенности". При этом если в случае наличия признака антилизоцимной активности изучаемой культуры оказывается возможным заключение об отнесении ее к резидентной микрофлоре (при этом дифференцируется от 10 до 30% штаммов), то отсутствие данного свойства не является информативным для принятия обратного решения (процент ошибки дифференциации ±41,6%).

Более точным и наиболее близким к заявляемому по совокупности признаков является способ дифференциации стафилококков, выделяемых от постоянных носителей (резидентные штаммы), и культур, изолируемых от непостоянных носителей (транзиторные штаммы), основанный на определении различий в уровне их устойчивости к антибактериальному действию крови (Л.М.Закарян, Н.А.Кочнева, А.Т. Дивавина. Устойчивость стафилококков, выделенных в больницах, к антибактериальному действию крови // Проблемы стафилококковых инфекций. - Саратов: Саратовский мед. ин-т, 1986. Ч.1. с.33-34). При осуществлении данного способа от бактерионосителей выделяют чистые культуры стафилококков, контактируют их с цитратной кровью кролика; при этом сразу же, а после 60-120-минутной инкубации при 37^oC производят высевы на чашки с мясо-пептонным агаром. На завершающем этапе подсчитывают количество выросших колоний и определяют устойчивость стафилококков к бактерицидному действию крови, выражаемому отношением числа выживших микробов к их исходному количеству (в). Высокая устойчивость к бактерицидному действию крови (более 50% выживших микробов) отмечена у 78,6% резидентных и лишь у 30,0% транзиторных штаммов, что позволяет использовать данный параметр в качестве дифференцирующего критерия.

Основной причиной, препятствующей получению требуемого технического результата, является нестандартность основного компонента, используемого в способе, цитратной крови кролика, бактерицидная активность которой может варьировать в широких пределах в зависимости от различных патологических и физиологических состояний, в том числе времени года, режима питания, суточного ритма и т.д. Необходимость содержания лабораторных животных и невозможность длительного хранения препарата крови без утраты ее бактерицидных свойств создает дополнительные трудности в осуществлении способа. В конечном счете накапливающиеся погрешности ведут к снижению информативности его применения: процент ошибки дифференциации резидентных штаммов составляет ±27,6% а транзиторных ±23,4%
Обобщенная характеристика выявленных способов-аналогов с указанием признаков, совпадающих с таковыми заявляемого способа, а также причин, препятствующих получению требуемого технического результата, представлена в табл. 1. Подводя итог данному разделу описания способа в целом, следует указать, что заявляемое изобретение не известно из уровня техники, т.е. является новым.

Основной задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является повышение точности дифференциации резидентной и транзиторной стафилококковой микрофлоры путем определения различий в их устойчивости к бактерицидным системам микроорганизма, осуществляемое за счет использования стандартного бактерицидного фактора, выпускаемого в виде коммерческого препарата. Попутной задачей является также упрощение процедуры выполнения способа.

Получаемый в результате выполнения заявляемого способа технический результат проявляется в повышении точности дифференциальной диагностики и упрощении процедуры выполнения бактериологического анализа.

Сравнительная характеристика действий, порядка их выполнения и условий осуществления в заявляемом способе и способе-прототипе представлена в табл. 2.

Как видно из представленных данных, оба способа на первом этапе их выполнения предполагают получение чистой культуры анализируемого микроорганизма. На втором этапе суточная культура стафилококка испытывается на устойчивость к бактерицидным системам микроорганизма (что определяет возможность к длительному переживанию и тем самым позволяет отнести ее к представителям резидентной микрофлоры). Однако на данном этапе заявляемый способ имеет существенные отличия от прототипа, т.к. если в способе-прототипе в качестве бактерицидной системы выступает цельная кровь, то в заявляемом способе это очищенный и стандартный препарат человеческого лейкоцитарного интерферона (М.Д.Машковский. Лекарственные средства. М. Медицина, 1985.-т.2.-с.386). Указанное принципиальное различие определяет ряд других технических особенностей способа: возможность непосредственного нанесения испытуемой культуры на агаровую пластину, являющуюся ростовой средой для стафилококка, и одновременно содержащую человеческий лейкоцитарный интерферон в определенных разведениях и тем самым выполняющую функцию бактерицидной системы. В способе-прототипе эти функции разобщены: первоначально проводится контакт стафилококка с бактерицидной системой свежей цитратной кровью, а затем нанесение выживших микроорганизмов на агаровую пластину, служащую для них ростовой средой. Невозможность объединения этих операций в одну определяется нестабильностью бактерицидных свойств крови при ее смешивании с агаром. В дальнейшем при осуществлении заявляемого способа, как и способа-прототипа, осуществляется инкубация агаровых пластин при 37^oC в течение 18-24 ч, в течение которых происходит размножение выживших микроорганизмов, формирующих макроколонии на агаре.

Завершающим этапом осуществления способа является учет бактерицидного эффекта в отношении испытуемой культуры стафилококка и диагностическая интерпретация полученного результата. Отличия в выполнении предыдущего этапа способа определяют особенности и данного этапа. Так, в способе-прототипе проводится подсчет выросших колоний микроорганизмов до и после контакта с бактерицидной системой цельной крови и их соотнесение с вычислением выживших колоний (значение > 50% рассматривается как критерий отнесения исследуемой культуры к числу "резидентных" штаммов). Уровень ошибки метода при использовании способа-прототипа оказывается достаточно высоким и составляет от ±23,4% до ±27,6%
При осуществлении заявляемого способа регистрации бактерицидного эффекта проводится качественно по наличию/отсутствию роста испытуемой культуры стафилококка на агаровых пластинах с различными (возрастающими) концентрациями препарат интерферона и характеризуется его минимальным разведением, при котором отмечается рост культуры. Диагностическая интерпретация результата проводится по достижении культурой определенного уровня устойчивости/чувствительности к бактерицидному действию препарата интерферона. При этом частные случаи касаются диагностических критериев устойчивости или чувствительности к бактерицидному действию препарата интерферона отдельно для золотистого стафилококка и отдельно для эпидермального стафилококка. Так отнесение золотистого стафилококка к числу "резидентых" культур осуществляется при уровне его устойчивости к разведению интерферона меньше или равном 1:20, а к числу "транзиторных" при уровне чувствительности к разведению интерферона равном или выше 1:80. Погрешность дифференциальной диагностики при этом составляет ±5,0% что соответствует приемлемому в медико-биологических исследованиях уровню ошибки. В случае изучения эпидермального стафилококка его отнесение к числу "резидентных" штаммов производится при уровне устойчивости к интерферону в разведении меньше или равном 1:80, а к числу "транзиторных" - при уровне чувствительности к разведению больше или равному 1: 320 (ошибка дифференциации ≅5%). В целом использование заявляемого способа позволяет повысить точность диагностики за счет снижения ошибки дифференциации в 4-5 раз.

Таким образом, сущностью заявляемого способа, сформулированной на уровне функционального обобщения и лежащей в его основе, является следующее: "резидентные" штаммы стафилококка отличает их высокая устойчивость к бактерицидному компоненту интерферона. Определение подобной устойчивости позволяет дифференцировать их от "транзиторных" штаммов стафилококков, для которых характерен высокий уровень интерфероночувствительности. С этих позиций заявляемый способ не следует из уровня техники, что позволяет оценить его как соответствующий критерию "изобретательский уровень".

Возможность получения технического результата в определенных интервалах значений признака определяется следующим комплексом причинно-следственных связей (табл.3.1. и 3.2.).

Приведенные в табл. 3.1. и 3.2. результаты сопоставления устойчивости (чувствительности) к препарату лейкоцитарного интерферона в группах стафилококков, одна из которых была представлена достоверно "резидентными", а другая достоверно "транзиторными" штаммами (дифференциация проводилась по Г.Н. Чистовичу (табл.1)), свидетельствуют о высоком уровне признака интерферонрезистентности в группе резидентных штаммов. В частности, устойчивость к интерферону в разведении 1:20 проявляли 85,3±6,1% золотистых стафилококков, выделенных от бактерионосителей резидентного типа, в то время как доля тразиторных штаммов, характеризующихся подобным уровнем интерферонрезистентности составила лишь 4,5±2,6% Полученные различия определяют возможность получения положительного эффекта дифференциации резидентных штаммов с вероятностью ошибки ≅5% в интервале значений их устойчивости к интерферону в разведении равном или меньше 1:20 от исходного. Понижение уровня диагностического порога в данном случае оказывается нецелесообразным, т.к. при этом ошибка дифференциации возрастает до ±24,4% при использовании в качестве пороговой величины разведения 1:40 и ±31,2% разведения 1:80.

С другой стороны, транзиторные штаммы золотистого стафилококка характеризовались высокой чувствительностью к интерферону, при этом чувствительность к разведению 1: 80 определялась у 56,0±6,1% транзиторных и лишь у 2,9±2,9% резидентных штаммов (ошибка дифференциации ±5,0%). При более низких разведениях выраженность различий в уровне интерферончувствительности в сопоставляемых группах оказывается менее значимой (ошибка дифференциации возрастает до ±8,1% и более), что из невозможности получения результата в других интервалах значений обосновывает порог значений интерферончувствительности, пригодный для дифференциации транзиторных штаммов на уровне 1:80 и выше.

Таким образом, комплекс приведенных выше фактов позволяет проводить дифференциацию резидентной микрофлоры вида золотистого стафилококка при определении уровня их устойчивости к разведению лейкоцитарного интерферона 1:20 и ниже, а транзиторной микрофлоры в случае обнаружения их чувствительности к разведению 1:80 и выше. Штаммы, характеризующиеся промежуточными значениями интерферонрезистентности/интерферончувствительно-сти и оказываются в зоне диагностической неопределенности.

Аналогичным образом определенные интервалы значений признака, в которых возможно получение необходимого результата для эпидермальных стафилококков, составили: устойчивость к интерферону в разведении 1:80 и ниже для отнесения к числу "резидентных" штаммов и чувствительность к интерферону в разведении 1:320 и выше для отнесения к числу "тразиторных" штаммов (табл.3.1. и 3.2.).

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения. Для проведения дифференциации резидентной и транзиторной микрофлоры со слизистой оболочки носовых ходов бактерионосителя одним из общепринятых методов выделяют чистые культуры стафилококков, которые идентифицируются до вида золотистый или эпидермальный стафилококк.

В дальнейшем последовательность выполнения действия при осуществлении заявляемого способа, их условия и режимы являются следующими.

Ампулу коммерческого препарата интерферона (М.Д.Машковский. Лекарственные средства. М. Медицина, 1985.-т.2.-с.386) согласно инструкции по его применению разводят в 2 мл стерильной дистиллированной воды, а затем в ряду пробирок в объеме 1 мл создают его разведения, соответствующие исходному, а также 1: 2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 и 1:64 от исходного. Питательный 1,5%-ный мясо-пептонный агар расплавляют, охлаждают до 45^oC и затем в объеме по 4 мл добавляют к каждому из приготовленных разведений, тщательно перемешивают и разливают ровным слоем в чашки Петри, так что итоговые разведения интерферона в агаре соответствуют 1:5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160 и 1:320 от исходного. Контролем служат чашки, залитые только 1,5%-ным питательным агаром.

Исследуемые культуры стафилококков выращивают на скошенном агаре в течение 18-24 ч при 37^oC, после чего их суспендируют в 0,85%-ном растворе хлорида натрия до конечных концентраций 1 млрд. микробных тел/мл и мерной петлей диаметром 2-3 мм наносят на поверхность агаровых пластинок, содержащих интерферон в указанных разведениях, а также на контроль. Чашки инкубируют при 37^oC в течение 18-24 ч, после чего производят учет результата по наличию/отсутствию роста макроколоний исследованных культур стафилококков на соответствующих разведениях интерферона при условии их роста в контроле. В соответствии с формулой изобретения с вероятностью не менее 95% к резидентным относят культуры золотистых стафилококков, проявляющих способность к росту при разведении интерферона 1:20 и ниже, и культуры эпидермальных стафилококков при росте в присутствии разведений интерферона 1:80 и ниже; а к транзиторным штаммы золотистых стафилококков при отсутствии роста на агаре с интерфероном в разведении 1:80 и выше, а эпидермальных 1:320 и выше.

Приводим конкретные примеры использования способа.

Пример 1. Со слизистой оболочки носовых ходов обследуемого Б. ватным тампоном был осуществлен посев на поверхность желточно- солевого агара, где после 18-24-часовой инкубации при 37^oC сформировались колонии микроорганизмов, дающие положительную лецитовителлазную реакцию, количество которых было оценено как 10²КОЕ/тампон. Одна из типичных колоний была выделена в чистой культуре и по совокупности морфологических (кокки, расположение гроздьями), тинкториальных (грамположительные), биохимических (ферментация глюкозы и магнита в анаэробных условиях) и биологических свойств (наличие плазмокоагулазы и ДНК-азы) идентифицирована как золотистый стафилококк. На данном этапе исследования обследуемый Б. может быть охарактеризован как бактерионоситель золотистого стафилококка, однако тип носительства в этом случае оказывается нераспознанным. При использовании способа- прототипа было установлено, что изученный штамм характеризуется устойчивостью к бактерицидному действию крови на уровне 45% КОЕ, что позволяет рассматривать его как транзиторный.

При использовании заявляемого способа используемый бактерицидный агент - коммерческий препарат лейкоцитарного интерферона был растворен в дистиллированной воде (2 мл на ампулу препарата) и после последовательным переносом 1 мл предыдущего разведения к 1 мл дистиллированной воды доведен до концентраций, соответствующих 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 и 1:64 от исходного. К данным разведениям интерферона добавляли по 4 мл предварительно расплавленного и остуженного до 45^oC 1,5%-ного питательного агара, после чего полученную смесь разливали ровным слоем в чашки Петри, так что конечная концентрация интерферона в агаре соответствовала 1:5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160 и 1: 320 от исходного. После застывания агара на его поверхность бактериологической петлей диаметром 2-3 мм были нанесены капли предварительно подготовленной взвеси суточной культуры стафилококка, суспендированной в 0,85%-ном растворе хлорида натрия до концентрации 1 млрд. микробных тел/мл. Посевы инкубировали при 37^oC в течение 18-24 ч, после чего оценивали уровень устойчивости/чувствительности исследуемой культуры золотистого стафилококка к бактерицидному компоненту интерферона по наличию/отсутствию ее роста на соответствующем разведении препарата. При этом установлено наличие роста на разведении 1:10, 1:20, 1:40, 1:80 и т.д. и его отсутствие на разведении 1:5, что в соответствии с формулой заявляемого способа позволяет идентифицировать исследуемую культуру золотистого стафилококка (по критерию устойчивости к интерферону в разведении 1:20 и менее) как резидентную. Проверка истинности дифференциации, проведенная по Г.Н.Чистовичу /табл.1/, показала верность диагноза по заявляемому способу и его ошибочность по способу-прототипу.

Пример 2. При бактериологическом анализе отделяемого передних отделов носовых ходов у 215 лиц из числа персонала крупного акушерско-гинекологического стационара у 100 человек были выделены культуры, идентифицированные как золотистые стафилококки, у 85 как эпидермальные стафилококки и у 30 лиц подобные анализы оказались отрицательными. Дальнейшая дифференциация выделенных культур проводилась с использованием заявляемого способа (см. пример 1) и способа-прототипа, а проверка точности дифференциации осуществлялась при последующем многократном анализе видовых и типовых характеристик стафилококков, выделяемых со слизистой оболочки носовых ходов в течении длительного периода наблюдений (по Г.Н.Чистовичу, табл.1).

Сравнительный анализ эффективности использованных методов представлен в табл.4.

Как видно из представленных данных, заявляемый способ позволяет резко снизить процент ошибки дифференциации: с 22,4 30,5% штаммов при использовании способа-прототипа до 2,9 3,4% штаммов при использовании заявляемого способа, а также несколько (в 1,15 1,20 раз) повысить число правильно идентифицированных культур. До 7,6 12,7% изученных культур при использовании заявляемого способа оказываются в зоне "диагностической неопределенности".

Таким образом, положительный результат, полученный при использовании заявляемого способа, выступает в виде повышения точности дифференциации и тразисторной микрофлоры, при бактерионосительстве. Дополнительными результатами являются повышение стандартности и упрощение выполнения дифференциации.

Использование: микробиология, дифференциация резидентной и транзисторной стафилококковой микрофлоры при бактерионосительстве, дифференциальная диагностика микроорганизмов. Сущность изобретения: определяют устойчивость (чувствительность) стафилококков, выделяемых в чистой культуре со слизистой оболочки носовых ходов бактерионосителей, к бактерицидным факторам, обеспечивающим состояние противоинфекционной резистентности. При этом в качестве бактерицидного фактора используют коммерческий препарат лейкоцитарного интерферона. Резидентным считаются культуры золотистого стафилококка, устойчивые к интерферону в разведении 1:20 и менее, и эпидермального стафилококка в разведении 1:80 и менее, а к тразиторным относят культуры золотистого стафилококка, чувствительные к интерферону в разведении 1:320 и более. Техническим результатом, достигаемым при использовании способа, является возможность дифференциации 83,9-89,5% культур стафилококков, выделяемых от бактерионосителей; при точности дифференциации не менее 95%. 2 з.п. ф-лы, 4 табл.

1. Способ дифференциации резидентной и транзиторной стафилококковой микрофлоры при бактерионосительстве путем выделения чистых культур стафилококков со слизистой оболочки верхних дыхательных путей, их видовой идентификации и последующего определения их устойчивости к бактерицидным факторам противоинфекционной резистентности, отличающийся тем, что в качестве бактерицидного фактора используют коммерческий препарат интерферона, при этом интерферонрезистентные культуры идентифицируют как резидентные, а интерферончувствительные как транзиторные. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что при дифференциации золотистых стафилококков резидентными считают культуры, устойчивые к интерферону в разведении 1 20 и менее, а транзиторными чувствительные к интерферону в разведении 1 80 и более. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что при дифференциации эпидермальных стафилококков резидентными считают культуры, устойчивые к интерферону в разведении 1 80 и менее, а транзиторными чувствительные к интерферону в разведении 1 320 и более.