СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СВЕЖЕГО ФЕКАЛЬНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ ВОДЫ ПОВЕРХНОСТНЫХ ВОДОЕМОВ Российский патент 1997 года по МПК C12Q1/04 G01N33/18 

Изобретение относится к медицине, в частности, к гигиене и санитарии, и может быть использовано при проведении санитарно-микробиологического анализа воды в системе мониторинговых работ по санитарно-гигиенической оценке поверхностных водоемов.

Важность раннего выявления свежего фекального загрязнения определяется необходимостью своевременного и эффективного проведения санитарно-эпидемиологических мероприятий. Поиск новых способов скрининговой диагностики является актуальной задачей санитарной микробиологии.

Известен способ определения свежего фекального загрязнения, заключающийся в выделении из исследуемой воды энтерококков и при индексе этих микроорганизмов свыше 500 предполагается поступление свежего фекального загрязнения. Однако биоиндикационная значимость энтерококков ограничена их высокой чувствительностью к солнечному свету и быстрой гибелью в поверхностных слоях воды [1]
Известен также способ определения кишечных вирусов, сущность которого состоит в количественном обнаружении кишечных вирусов в исследуемом объеме воды путем предварительной концентрации их осаждением сернокислым алюминием и фильтрации с последующим вирусологическим исследованием концентрата [1] Осуществление способа требует наличия вирусологической лаборатории, проведения специальных манипуляций и напрямую зависит от тщательности выполнения подготовительных работ.

Наиболее близким к заявляемому способу по совокупности существенных признаков является способ определения свежего фекального загрязнения поверхностных водоемов, включающий анализ количественного содержания E. coli в объеме исследуемой воды с последующим расчетом соотношения лактозо-позитивных кишечных палочек (ЛКП) и E. coli. Присутствие в исследуемой воде E. coli свыше 1000 КОЕ/л свидетельствует о недавнем поступлении хоз-фекальных сточных вод. В этих случаях соотношение числа ЛКП и E. coli < 10 [2]
Недостатком данного способа является необходимость выполнения большого числа манипуляций, кроме того, способ не позволяет учитывать рост измененных и замедленно реагирующих форм микроорганизмов. Необходимо учитывать и то, что в научно-технической литературе описаны случаи проникновения в водопроводную сеть патогенной и условно-патогенной и условно-патогенной микрофлоры при нормальных величинах соотношения ЛКП/к.п. [3] Оценка санитарно-гигиенического состояния воды опирается на количественные показатели, однозначная оценка и интерпретация которых в условиях возрастающей антропогенной нагрузки затруднена [4] Таким образом, описанный способ имеет ряд недостатков, препятствующих точному определению свежего фекального загрязнения поверхностных водоемов.

Заявляемый способ решает задачу повышения точности биоиндикации свежего фекального загрязнения воды поверхностных водоемов.

Для решения указанной задачи в заявляемом способе определения свежего фекального загрязнения воды поверхностных водоемов, включающего микробиологическое выделение ЛКП, дополнительно у выделенных микроорганизмов определяют антилизоцимную, антикомплементарную и "антиинтерфероновую" активность и при уровне выраженности этих признаков АЛА≥4 мкг/мл, АКА≥0,5 анти/ЛЕК и АИА≥0,1 усл. ед. судят о наличии свежего фекального загрязнения.

Новым в заявляемом способе является то, что в качестве инструмента биоиндикации используются персистентные свойства ЛКП: антилизоцимная (АЛА), антикомплементарная (АКА) и "антиинтерфероновая" (АИА) активности, а также уровни их выраженности. По факту присутствия в воде ЛКП, обладающих комплексом указанных признаков, уровень выраженности которых составляет АЛА≥4 мкг/мл, АКА≥0,5 анти/ЛЕК и АИА≥0,1 усл. ед. судят о наличии свежего фекального загрязнения.

Разработка заявляемого способа стала возможной после определения ряда моментов:
1. Преимущество кишечной палочки как санитарно-показательного микроорганизма несомненно. Однако биоиндикационная значимость методов с использованием этих микроорганизмов различна и качественные показатели в ряде случаев более информативны в отношении регистрации изменения санитарного состояния воды. Так факторы персистенции указанных бактерий, в частности их антилизоцимная, антикомплиментарная и "антиинтерфероновая" активность являются маркерами санитарного неблагополучия [5]
2. Факторы персистенции отражают преимущественное детерминирование микроорганизмов в условиях макроорганизма. То есть, биологические признаки кишечных палочек присутствовавших в организме человека будут отражать ту среду, где они находились, и при поступлении эшерихий в воду будут свидетельствовать об их организменном происхождении.

Полученные экспериментальные данные показали различие выраженности факторов персистенции у штаммов выделенных из организма людей и из водных источников. При этом, персистентные характеристики ЛКП организменного происхождения превышают значения АЛА, АКА и АИА у водных штаммов в диапазоне кратности от 1,5 до 10 раз.

3. Лабораторные исследования по искусственному внесению, выделенных из организма человека штаммов с выраженными персистентными свойствами, в аквариум, показали, что внесенные культуры сохраняли исходный уровень персистентных свойств до 3 5 суток с последующим плавным его снижением.

4. Проведенные натурные исследования позволили определить диапазоны выраженности персистентных свойств микроорганизмов группы ЛКП для чистых зон и зон подвергшихся свежему фекальному загрязнению (табл. 1).

Из табл. 1 видно, что при свежем фекальном загрязнении у ЛКП выявлено превышение уровней их персистентных характеристик, которое колебалось в диапазоне кратности от 1,5 до 10 раз в сравнении с бактериями, выделенными из чистых зон.

Таким образом, обнаружение у ЛКП персистентных свойств с определенным уровнем выраженности позволяет регистрировать свежее фекальное загрязнение и установить точно, когда оно произошло. Преимущественная детерминированность микроорганизмов с персистентными свойствами в условиях макроорганизма позволяет определять "организменное" происхождение эшерихий, выделенных из водных объектов.

Предлагаемый способ позволяет повысить точность биоиндикации свежего фекального загрязнения и возможность более достоверного определения санитарно-гигиенического состояния водоема.

Способ осуществляется следующим образом.

Исследуемый материал воду из открытого водоема отбирают в стерильные флаконы батометром. В течение первых 6 часов осуществляют фильтрацию через мембранные фильтры с диаметром пор 0,5 мкм 4-х десятикратных объемов так, чтобы в последствии не менее, чем на 2-х фильтрах получить не более 30 колоний, относящихся к группе лактозо-позитивных кишечных палочек. Фильтры укладывают в чашки Петри на среду ЭНДО. Чашки с посевами помещают в термостат и инкубируют при 37±0,5^oC в течение 16 18 ч. Затем снимают характерные для бактерий группы ЛКП колонии (темно-красные с металлическим блеском и без блеска, красные, розовые и с темно-красным центром) и определяют у них наличие и уровень антилизоцимной, антикомплементарной и "антиинтерфероновой" активностей. Определение АЛА осуществляется чашечным методом с использованием отстроченного антагонизма, в качестве индикатора берется культура M. lysodeikticus [6] Антикомплементарная активность микроорганизмов определяется по методу парциального гемолиза в геле, основанному на подавлении комплементзависимого иммунного гемолиза сенсибилизированных эритроцитов барана [7] "Антиинтерфероновая" активность определяется чашечным методом с использованием отсроченного антагонизма в отношении индикаторного штамма C. xerosis [8]
Пример 1. С целью определения свежефекального загрязнения нами были взяты пробы воды из следующих источников:
бытовые сточные воды, поступающие на городские очистные сооружения;
сбросные воды, поступающие в р. Урал после очистки с городских очистных сооружений;
вода, поступающая на водозабор.

Интегрированные пробы воды отбирались пробоотборником в стерильные флаконы. В лабораторных условиях пробы фильтровались через мембранные фильтры с диаметром пор 0,5 мкм и помещались в чашки Петри на среду ЭНДО. После инкубации при 37^oC в течение 16 18 ч у выросших колониями микроорганизмов определялись АЛА, АКА и АИА. В хозяйственно-бытовых сточных водах согласно прототипу зарегистрировано более 2400 КОЕ/л, индекс ЛКП/к.п. <10, что соответствовало свежему фекальному загрязнению. Уровень АЛА выделенных ЛКП 6 8 мкг/мл. У 40% штаммов регистрировалась одновременно с антилизоцимной и антикомплементарная активность, уровень выраженности которой составил 0,4 2,2 анти/ЛЕК. У 20% эшерихий присутствовал "АИА" признаков значениях 0,1 усл. ед. Результаты, полученные обоими использованными способами свидетельствуют о свежем фекальном загрязнении.

В сбросных водах, прошедших очистку на городских очистных сооружениях, количество зарегистрированных кишечных палочек было 910 КОЕ/л, индекс ЛКП/к. п. >10, по способу взятому за прототип регистрировалось благополучное состояние, свидетельствующее об эффективности разбавления сбросных вод. Однако среди выделенных ЛКП регистрировались штаммы обладающие персистентными свойствами. У 20% выделенных микроорганизмов регистрировалась АЛА 6 7 мкг/мл и АКА 0,5 0,6 анти/ЛЕК и АИА 0,1 0,3 усл. ед. Результат расценен как положительный, свидетельствующий о свежем фекальном загрязнении.

В речной воде, полученной у городского открытого водозабора, нами выявлено 43 КОЕ/л, относящихся к ЛКП. Среди них регистрировались микроорганизмы с наличием либо антилизоцимного, либо антикомплементарного признака, но кишечных палочек с присутствием трех признаков обнаружено не было. Уровень выраженности исследуемых свойств у обнаруженных микроорганизмов не превышал допустимый. Результат расценен как отрицательный. Материалы, исследованные с использованием способа, взятого за прототип, также дали отрицательные результаты.

Пример 2. Исследования по изучению санитарно-гигиенического состояния воды водоемов Уральского бассейна с применением способа-прототипа и предлагаемого способа выявили объекты, подвергающиеся свежему фекальному загрязнению (табл. 2). Из табл. 2 видно, что сравнительный анализ данных, полученных при использовании для диагностики свежего фекального загрязнения разработанного способа и взятого за прототип, показал, что в ряде случаев регистрировались совпадения результатов исследований по пунктам 1, 2, 3, 4 табл. 2, однако, наблюдались расхождения результатов по п.п. 5 и 6 (табл. 2) в пользу предлагаемого способа.

Пример 3. В процессе гидробиологических исследований на Ириклинском водохранилище обнаружено две зоны с высокой антропогенной нагрузкой. Одна из зон подвержена термальным выбросам сбросных вод с ГРЭС, имеющим выраженный техногенный характер. Вторая зона связана с притоком речных вод из Таналычки, содержащих большое количество промзагрязняющих веществ, а также с поступлением хоз-фекальных стоков от отстаивающихся в этом месте судов.

В зоне сброса термальных вод количество ЛКП в 1 л исследуемой воды не превышало 500 КОЕ. Среди выделенных микроорганизмов не обнаружено штаммов с наличием антикомплементарной и "антиинтерфероновой" активностей, а регистрируемый антилизоцимный признак не превышал уровня 2 мкг/мл.

Во второй зоне (станция 10) в пробах поверхностных вод зарегистрированы ЛКП в количестве 500 КОЕ/л. Индекс ЛКП/к.п.>10. При этом в соответствии со способом-прототипом вода признана свободной от свежего фекального загрязнения. Однако, разработанным методом в исследуемых пробах воды обнаруживались около 200 штаммов ЛКП, обладающих всеми тремя признаками. Уровень выраженности их персистентных свойств колебался в пределах: АЛА 4 7 мкг/мл, АКА 0,5 - 0,7 анти/ЛЕК и АИА 0,1 0,2 усл. ед. В результате было зарегистрировано свежее фекальное загрязнение. Отбор проб на ст. 10 производился также при стоянке корабля непосредственно после сброса хоз-фекальных вод. Количество ЛКП в пробах повысилось до 1200 КОЕ/л число штаммов, обладающих комплексом персистентных свойств, увеличилось до 400 КОЕ/л. Уровень выраженности указанных показателей колебался в диапазоне кратности от 1,5 до 10 раз по сравнению с чистой зоной.

Полученные данные могут свидетельствовать в пользу организменного происхождения циркулирующих на станции 10 штаммов из группы ЛКП и определить аллохтонные привносы, характеризующиеся несомненным антропогенным происхождением. В термальных водах зарегистрировано отсутствие микроорганизмов из группы ЛКП с выраженными персистентными свойствами, следовательно, микрофлора этих вод носит автохтонный характер и подвержена лишь техногенному влиянию.

Определение у выделенных микроорганизмов группы ЛКП уровня выраженности их АЛА, АКА и "АИА" признаков является с одной стороны надежным критерием оценки свежести фекального загрязнения, а с другой позволяет вычленить из аллохтонных привносов бактериальную составляющую организменного происхождения, в т.ч. антропогенного.

Таким образом, предлагаемый способ определения свежего фекального загрязнения воды поверхностных водоемов обеспечивает повышение точности на 30% и достоверности биоиндикации свежего фекального загрязнения за счет
использования в качестве биоиндикационного параметра качественных характеристик ЛКП, в частности их персистентных свойств;
установления диапазонов выраженности антилизоцимной, антикоплементарной и "антиинтерфероновой" активности.

Использование: медицина, а именно гигиена и санитария, может быть использовано при проведении санитарно-микробиологического анализа воды в системе мониторинговых работ по санитарно-гигиенической оценке поверхностных водоемов. Сущность изобретения: способ осуществляют путем микробиологического выделения из воды исследуемых водоемов ЛКП, у выделенных микроорганизмов определяют их персистентные свойства. При этом, если из воды выделяют микроорганизмы, несущие одновременно АЛА, АКА и АИА признаки в диапазоне ≥4 мкг/мл, ≥0,5 анти/ЛЕК и ≥0,1 соответственно, регистрируют свежее фекальное загрязнение. 2 табл.

Способ определения свежего фекального загрязнения воды поверхностных водоемов, включающий микробиологическое выделение лактозо-позитивных кишечных палочек, отличающийся тем, что у выделенных микроорганизмов определяют антилизоцимную, антикомплементарную и антиинтерфероновую активность (АЛА, АКА и АИА соответственно) и при уровне выраженности этих признаков АЛА ≥ 4 мкг/мл, АКА ≥ 0,5 анти/ЛЕК и АИА ≥ 0,1 усл. ед. судят о наличии свежего фекального загрязнения.