Изобретение относится к медицинской микробиологии и относится к способам определения биологических свойств микроорганизмов, в частности определения их способности к инактивации бактерицидных систем макроорганизма, а именно к способам определения способности бактерий инактивировать комплемент.
Изобретение предназначено для использования в лабораториях научно-исследовательских институтов и бактериологических лабораториях клинических учреждений, занимающихся вопросами определения вирулентных и персистентных характеристик микроорганизмов (в эксперименте), а также установление их этиологической значимости при патологических процессах (в клинике).
Актуальность разработки способа определения антикомплементарной активности бактерий определяется возникающей при этом возможностью повышения точности бактериологической диагностики, выбора рациональной антибактериальной терапии, контроля эффективности лечения и прогнозирования течения заболеваний микробной этиологии.
В настоящее время для решения подобных задач у микроорганизмов изучается ряд их биологических свойств: гемолитической, ДНК-азной, фибринолитической и др. , способностей [1] . Указанные способы осуществляются путем выращивания изучаемых бактерий на питательных средах, содержащих в качестве добавки вещество, способность разрушать (лизировать, ферментировать), которое и исследуется в каждом конкретном случае.
Основным недостатком перечисленных способов-аналогов является низкая информативность изучаемых параметров в определении действительной вирулентности (этилогической значимости) исследуемых бактериальных культур. Причиной этого является тот факт, что используемые методы не направлены на изучение способности бактерий инактивировать механизмы естественной резистентности макроорганизмов, являющиеся важнейшими звеньями патогенеза инфекционных заболеваний.
В этой связи в настоящее время все большее внимание уделяется изучению свойств патогенных микроорганизмов, направленных на инактивацию факторов естественной резистентности организма-хозяина. Среди способов, направленных на изучение подобных свойств, описаны способы определения антилизоцимной [2] и антиинтерфероновой [3] активностей бактерий.
Указанные методы основаны на определении инактивации антибактериального вещества (соответственно: лизоцима или интерферона), добавляемого в плотную питательную среду, на которой выращиваются испытуемые культуры бактерий. После 24-48-часовой инкубации в термостате бактериальные культуры инактивируют в парах хлороформата и заливают вторым слоем плотной питательной среды, содержащей индикаторный микроорганизм (соответственно: микрококкус лютеус - на лизоцим; коринебактерия ксерозис - на интерферон). Об инактивации антибактериального вещества судят по наличию роста индикаторной культуры вокруг колонии испытуемого бактериального штамма.
Однако указанные способы не позволяют проводить определение способности бактерий к инактивации одной из ведущих бактерицидных систем макроорганизма - системы комплемента, играющего ключевую роль в уничтожении микроорганизмов с преимущественно внеклеточным типом паразитирования, из-за чего полноценная "расшифровка" возбудителя, ограничивающая использованием только способов-прототипов, оказывается невозможной.
В связи с этим целью заявляемого способа является определение способности бактерий к инактивации системы комплемента (антикомплементарной активности бактерий).
Для достижения поставленной цели (см. таблица) на поверхность 1,5% питательного агара, разлитого в объеме 5 мл в чашки Петри, расположенные на строго горизонтальной поверхности, петлей или пастеровской пипеткой наносят взвесь исследуемых культур в физиологическом растворе хлорида натрия (оптич. плотность 1,0 по стандарту мутности). Чашки с посеянными на них культурами инкубируют в течение 18-24 ч при 37оС для проявления ими их биологических свойств. После этого исследуемые культуры инактивируются в парах хлороформа в течение 10 мин и чашки заливаются на горизонтальной поверхности вторым слоем, содержащим 1,5 мл агара и комплемента (смесь пула сывороток 15-20 доноров, оттитрованная в гемолитической системе до активности 50 ед. , 25 ед. и 12,5 ед/мл). Чашки инкубируются в перевернутом состоянии при 37оС в течение 1 ч для осуществления антикомплементарного действия бактерий и продуктов их жизнедеятельности. Затем чашки Петри заливаются третьим слоем 0,7% питательного агара, содержащего 0,1 мл взвеси в физиологическом растворе (оптич. плотность 0,5 по стандарту мутности) индикаторной культуры кишечной палочки 212 (ГИСК им. Л. А. Тарасевича) находящейся в R-форме и проявляющей повышенную чувствительность к бактерицидному действию системы комплемента. Чашки инкубируются в термостате в течение 18-24 ч для выявления инактивации комплемента бактериями. Об антикомплементарной активности судят по наличию зон роста индикаторной культуры вокруг испытуемых культур бактерий, где произошла инактивация комплемента.
Обоснованием для создания настоящего способа послужили исследования по выбору индикаторной культуры, позволяющей тестировать наличие или отсутствие в среде комплемента. По результатам изучения 500 клинических и музейных штаммов грамотрицательных бактерий с последующим клональным отбором была выделена культура кишечной палочки, проявляющая наибольшую чувствительность к бактерицидному действию комплемента производная от Е. coli К 12 и депонированная в ГИСК им. Л. А. Тарасевича под регистрационным N 212.
Изучение чувствительности Е. coli 212 к бактерицидному действию различных сывороток 50 доноров продемонстрировало высокую степень корреляционной связи (ρ = 0,71) с содержанием в них комплемента, определенным классическим методом в гемолитической системе. В то же время отобранный клон был резистентен к лизоциму и интерферону, используемым в качестве бактерицидных веществ при тестировании антилизоцимной и антиинтерфероновой активностей.
Основным свойством E. coli 212, определяющим целесообразность ее использования в заявляемом способе, является высокий уровень чувствительности к комплементу, который тестируется следующим образом.
В плотных питательных средах создаются концентрации комплемента сыворотки крови, соответствующие его активности в гемолитической системе 20; 15 и 5 гем. ед. /мл. После этого наслаивают второй слой агара в объеме 2 мл, содержащий 50 млн, микробных тел E. coli 212. Процент выживших микроорганизмов (сформировавшихся колоний) подсчитывают после 18-24-часовой инкубации при 37оС. Результатами испытания установлено, что комплемент в концентрации от 20 до 5 гем. ед. /ммл оказывает выраженное бактерицидное действие на кишечную палочку 212 (> 99,9% ), что позволяет использовать ее в качестве тест-культуры на комплемент.
Предлагаемый штамм Е. соli 212 находится в R-форме, растет на простых питательных средах в виде шероховатых полупрозрачных колоний диаметром 2-3 мм, ферментирует глюкозу, дульцит, трегаллозу, сорбит, рамнозу, лактозу, маннит, декарбоксилирует лизин, образует индол, не расщепляет сахарозу, целлобиозу, адонит, инозит, не дезаминирует фенилаланин, не образует ацетилметилкарбинол, не разлагает мочевину, не утилизирует цитраты, не образует сероводород. Чувствителен к мономицину, канамицину, гентамицину, карбенциллину, левомицетину, тетрациклину, доксициклину; устойчив к линкомицину, эритромицину, олеандомицину, оксациллину, метилциллину, пенициллину, стрептомицину. Проверка на вирулентность на модели экспериментальной инфекции на мышах и морских свинках показала, что штамм не вирулентен.
Требования к бактерицидному веществу (комплементу), используемому при осуществлении способа, определяются тем фактом, что количество комплемента в сыворотке крови человека является индивидуальной вариабельной величиной, в качестве источника комплемента используется смесь пула сывороток 15-20 доноров, что позволило нивелировать индивидуальные различия и получить итоговую активность комплемента на уровне 60-70 гемолитических ед/мл. В дальнейшем полученная смесь, содержащая комплемент, тестируется в гемолитической системе и разводится до активности 50 гем. ед/мл. Для добавления во второй слой используют по 1 ммл разведений, содержащих соответственно 50, 25 и 12,5 гем. ед/мл, которые перед наслаиванием смешивают с 1,5 мл агара, так что конечная концентрация комплемента составляет соответственно 20; 10 и 5 гем. ед/мл.
Быстрая инактивация комплемента во времени (снижение активности на 100% за 5,5-6 ч) делает невозможным его добавление в слой агара, на котором выращивается испытуемая бактериальная культура. Указанная особенность определила необходимость применения "трехслойной" методики, при которой комплемент в слое агара наслаивается на уже выращенную испытуемую культуру. При этом происходит диффузия как самого комплемента к испытуемой бактерии, так и диффузия продуктов жизнедеятельности бактерий в слой, содержащий комплемент, в процессе чего реализуются антикомплементарные свойства испытуемых бактерий. Экспериментально установленное время, достаточное для подобной диффузии, составляет 1 ч.
Способ осуществляется следующим образом.
П р и м е р 1. Из гнойного отделяемого больного К. с открытой раной бедра выделена культура стафилококка. Изучение биологических свойств позволило идентифицировать ее как St. aureus по наличию лецитовителлазной активности, анаэробной ферментации маннита и продукции ДНК-азы. Однако отсутствие выраженных признаков вирулентности: плазмокоагулирующей, гемолитической активностей, а также антилизоцимной и антиинтерфероновой активностей поставило под сомнение этиологическую роль выделенного микроорганизма в развитии воспалительного процесса. Для решения данного вопроса у выделенной культуры золотистого стафилококка была изучена способность к инактивации комплемента - важнейшего звена противоинфекционной защиты. Наличие подобного свойства, даже в отсутствие иных факторов вирулентности, определяет возможность этиологического агента инициировать и поддерживать воспалительный процесса.
Для достижения поставленной цели испытуемую бактериальную культуру выращивали на плотной питательной среде, инактивировали ее в парах хлороформа и на посев наслаивали второй слой агара, содержащий комплемент в концентрации 5-20 гем. ед/мл. По истечении 1-часового контакта комплемента с бактериальной культурой золотистого стафилококка и продуктами ее жизнедеятельности при 37оС, во время которого происходит реализация антикомплементарной активности, проводили наслаивание третьего слоя питательного агара, содержащего индикаторную культуру кишечной палочки N 212 ГИСК, находящуюся в R-форме и являющуюся высокочувствительной к комплементу. После 18-24-часовой инкубации, во время которой происходит проявление бактерицидного действия комплемента на индикаторную культуру, определили наличие антикомплементарной активности по росту тест-культуры вокруг колонии испытуемой культуры золотистого стафилококка, где произошла инактивация комплемента.
Таким образом, выявление у данного стафилококка способности инактивировать комплемент позволило подтвердить его этиологическую значимость, что было подтверждено повторными высевами данного микроорганизма во время течения воспалительного процесса. Изучение спектра чувствительности к антибиотикам и проведение целенаправленной антибиотикотерапии привело к санации раны и ликвидации воспалительного процесса, что также подтверждает этиологическую значимость выделенного микроорганизма.
П р и м е р 2. Из мочи больной Н. с диагнозом "Хронический пиелонефрит", выделен Streptocuccus pyigenes в титре 104 /мл, у которого в соответствии с п. 1 установлено наличие антикомплементарной активности. У данного микроорганизма методом диффузии в агар установлена чувствительность к пенициллину, гентамицину, канамицину и амикацину. Курс антибиотикотерапии с использованием пенициллина по 1 млн. ЕД 6 раз в день в течение 5 дней однако не привел к санации мочи, лишь снизив титр ее обсемененности до 102/мл, и не сопровождался положительной динамикой клинических симптомов. В связи с этим было изучено влияние субингибиторных концентраций названных антибиотиков на антикомплементарную активность стрептококка. Установлено, что пенициллин не оказывает на нее выраженного действия (что, очевидно, объясняет неэффективность его использования в данном случае), сизомицин и канамицин снижают ее незначительно, а гентамицин оказывает выраженное ингибирующее влияние: штамм стрептококка, выращенный в контакте с суббактериостатической концентрацией гентамицина, утрачивая свою исходную антикомплементарную активность. Проведение курса антибиотикотерапии с использованием гентамицина как препарата, снижающего антикомплементарную активность возбудителя (стрептококка), позволило достичь длительной клинико-лабораторной ремиссии с полной санацией мочи. (56) 1. Справочник по микробиологическим методам исследования. Под ред. Биргера М. О. , М. : Медицина, 1982, с. 464.
2. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1984, N 2, с. 27-29.
3. Авторское свидетельство N 1564191, кл. С 12 Q 1/02, 1988.
Использование: медицинская микробиология. Сущность изобретения: способ осуществляется путем выращивания исследуемых бактериальных культур на плотных питательных средах в течение 18 - 24 ч для проявления бактериями своих биологических свойств; их инактивации в парах хлороформа; наслаивания второго агара, содержащего комплемент в концентрации 5 - 20 гем. ед. /мл (в качестве комплемента используется смесь сывороток 15 - 20 доноров) и 1-часовой инкубации при 37С, во время которой осуществляется антикомплементарное действие бактерий и продуктов их жизнедеятельности; последующего наслаивания третьего слоя агара, содержащего индикаторную культуру кишечной палочки E. coli ГИСК, N212, высокочувствительной к бактерицидному действию комплемента (клон 12/03, производный от E. coli К12, находящийся в R-форме); учет результата проводиться через 18 - 24 ч инкубации при 37С по зонам роста индикаторной культуры вокруг бактерий, где произошла инактивация комплемента.
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИКОМПЛЕМЕНТАРНОЙ АКТИВНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ, заключающийся в том, что исследуемую культуру микроорганизмов выращивают на плотной питательной среде, инактивируют ее в парах хлороформа, на посев наслаивают второй слой агара, содержащий комплемент в концентрации 5 - 20 гем. ед/мл, инкубируют 1 ч при 37oС и наслаивают третий слой, содержащий индикаторную культуру Escherichia coli ГИСК N 212, посев инкубируют и определяют антикомплементарную активность микроорганизмов по наличию роста тест-культуры вокруг колоний испытуемой культуры.
