СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГИСТОНОВОЙ АКТИВНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 1996 года по МПК C12Q1/02 C12Q1/02 C12R1/285 

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и может быть использовано при определении биологической активности микроорганизмов.

С точки зрения медицинской микробиологии особое значение имеет технология определения биологической активности микроорганизмов по отношению к ключевым структурным и функциональным белкам микроорганизма. Изучение этих активностей позволило установить антикомплементарную, антииммуноглобулиновую, антилизоцимную, антиинтерфероновую активности микроорганизмов, на базе которых разработан ряд способов, используемых в медицине [1,2,3,4]
До настоящего времени, каких-либо исследований по определению активности бактерий в отношении важнейших белков хроматина-гистонов не проводилось. Соответственно, поэтому не существовало и способов обнаружения антигистоновой активности микрооргангизмов, что не позволяет выбрать прототип изобретения.

Между тем, гистоны основные ядерные белки всех эукариотических организмов, играют доминирующую роль в структурной организации хроматина и связанной с ней экспрессии и активации генов [5] Давно известна и хорошо изучена антимикробная активность гистонов и различная чувствительность к ним микроорганизмов [6] но способность бактерий к инактивации гистонов в литературе не описана.

Целью изобретения является разработка способа определения антигистоновой активности микроорганизмов.

Указанная цель достигается тем, что в способе определения антигистоновой активности микроорганизмов исследуемые бактерии высевают на плотную питательную среду с подобранными концентрациями гистонов. Посев осуществляют локально на поверхность среды. После инкубации культуру инактивируют и наслаивают второй слой питательной среды в которой суспендируют тест-культуру Micrococcus lysodeikticus ГИСК 2665. После повторной инкубации посевов в течение 24 часов изучают локализацию колоний тест-культуры. Если исследуемая культура обладает антигистоновой активностью, то вокруг колоний вырастают колонии тест-культуры.

Для осуществления способа в качестве тест-культуры к гистонам используют известный штамм Micrococcus lysodeikticus ГИСК 2665 Культурно-моpфологические признаки штамма: величина клеток суточной культуры на обычном мясо-пептонном агаре 1,5-2 мк. Грамположительны, располагаются поодиночке и в парах, образуют неправильные группы и тетрады. Хорошо растут на простых питательных средах. На мясо-пептонном бульоне растет в виде равномерной взвеси. На мясо-пептонном агаре образует ровные гладкие колонии с желтым пигментом диаметром 1 мм.

Физико-химические признаки
Развивается в аэробных условиях. Оптимум роста 25-30^oС. Растет при концентрации хлорида натрия до 5% Не расщепляют мальтозу, маннит, галактозу и глюкозу. Чувствителен к эритромицину, тетрациклину, пенициллину, стрептомицину. Чувствителен к яичному лизоциму/литическое действие/в концентрации 1 мкг. [3]
Чувствителен к общей фракции гистонов ("Сигма") МБК 0,8 мкг/мл. Способ осуществляется следующим образом:
Пример N1 У 100 штаммов бактерий, выделенных с переднего отдела слизистой носа обследуемых лиц определяли антигистоновую активность. С этой целью готовили четыре ряда чашек Петри. Чашки заливали 1,5% мясо-пептонным агаром содержащим гистоны в восходящей концентрации: 0,4; 0,8; 3,2; 4,5; 8; 10 мг/мл агара. После застывания среды и ее подсушивания на поверхность агара локально (в виде отдельных "пятачков") засевали петлей суточную культуру исследуемых штаммов. На каждый ряд чашек засевали по 25 штаммов. Чашки инкубируют сутки при 37^oС, после чего выросшие культуры убивают парами хлороформа 20 мин. на инактивированные культуры наслаивают второй слой питательного 0,7% агара (3-4 мл), содержащим взвесь суточной культуры Micrococcus lusodeiktius ГИСК N2665. Чашки инкубируют повторно 24 часа при 37^oС. Величину антигистоновой активности бактерий определяют по наличию роста тест культуры вокруг колоний испытуемой культуры по чашке с максимальной концентрацией гистонов, на которой выявилась еще активность исследуемого штамм. Результаты распределились следующим образом:
На чашках с концентрацией гистонов 0,4 мг/мл учет антигистоновой активности был невозможен из-за сплошного фонового роста тест культуры по всей чашке. Таким образом, нижняя концентрация гистонов в среде определяется чувствительностью к гистонам тест-культуры.

На чашках с концентрацией гистонов 0,8 мг/мл из 100 штаммов активность выявлена у 43. Это же число активных штаммов выявилось и на концентрации гистонов в среде 3,2 мг/мл. На концентрации гистонов 4 мг/мл число активных штаммов уменьшилось на 2 и составило 41 (табл.1). То есть у 2 штаммов эпидермального стафилококка антигистоновая активность определялась верхним пределом 3,2 мг/мл. На концентрации гистонов в среде 5 мг/мл число активных штаммов понизилось с 41 до 20. Таким образом, у 21 штамма золотистого стафилококка антигистоновая активность составила 4 мг/мл (табл.1). У 20 оставшихся штаммов, среди которых коринебактерии, нейссерии, микрококки Антигистоновая активность продолжала выявляться на концентрации гистонов в среде 8, 10 мг/мл. Таким образом, верхний предел концентрации в среде гистонов, определяется индивидуально для выявления максимальной активности каждого испытуемого штамма. Представленный пример поясняется таблицей 1.

Как видно из таблицы в результате применения заявляемого способа удалось зарегистрировать неизвестное ранее свойство бактерий, антигистоновую активность (АГА) и изучить распространение ее у разных видов микроорганизмов.

Пример N2. Определяли АГА у штаммов бактерий, выделенных с переднего отдела слизистой носа лиц, проживающих в двух различных по заболеваемости регионах. В первом регионе заболеваемость органов дыхания на 1000 населения составило 1347, процент антигистонактивных штаммов, выделенных от этого контингента, составил 44% Во втором регионе заболеваемость составила 1117, количество антигистонактивных штаммов, выделенных от жителей данного региона, составило 14% В приведенном примере число бактерионосителей штаммов с новой биологической активностью, обнаруженной предлагаемым методом, косвенно отражает уровень инфекционной заболеваемости органов дыхания жителей разных регионов.

Пример N3. Наличие АГА впервые выявленное предложенным способом позволило предположить инвазию бактерий в место первоначального расположения гистонов в ядро клетки. Это предположение было подтверждено на светомикроскопическом уровне. Результаты данного исследования позволяют поставить вопрос о качественно новом, ядерном уровне взаимодействия бактерия-макроорганизм.

Таким образом, использование предлагаемого способа позволило впервые выявить и начать изучение АГА бактерий разных видов, впервые поставить вопрос о бактериальной инфекции ядра клетки макроорганизма и подтвердить это на светомикроскопическом уровне, провести косвенную оценку заболеваемости населения по частоте встречаемости штаммов бактерий с АГА выделенных от данного контингента населения. ТТТ1

Использование: медицинская микробиология. Сущность изобретения: исследуемую культуру высевают локально на плотную питательную среду, содержащую гистоны в концентрации, достаточной для выявления максимальной активности испытуемой культуры, но не менее 0,8 мг/мл. После инкубации культуру инактивируют и наслаивают второй слой питательной среды, в которой суспендирована тест-культура Micrococcus lysogeikticus ГИСК 2665. Заключение о наличии у исследуемой культуры антигистоновой активности делают при появлении роста тесткультуры вокруг колоний испытуемой культуры микроорганизмов. 1 табл.

Способ определения антигистоновой активности микроорганизмов, заключающийся в том, что исследуемую культуру микроорганизмов выращивают на питательной среде в присутствии гистонов в концентрации не менее 0,8 мг/мл и одновременно достаточной для выявления максимальной активности испытуемой культуры, выросшую культуру инактивируют, на посев наслаивают второй слой питательной среды, содержащий взвесь тест-культуры Micrococcus lysodeiticus ГИСК N 2665, посев инкубируют и определяют антигистоновую активность микроорганизмов по наличию роста тест-культуры вокруг колоний испытуемой культуры.