СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ КИШЕЧНОГО ДИСБИОЗА И КИШЕЧНОЙ ИНФЕКЦИИ Российский патент 1997 года по МПК G01N33/569 G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, в частности к медицинской микробиологии, и может быть использовано для диагностики кишечного дисбиоза и кишечной инфекции.

В последние годы повсеместно отмечается значительный рост заболеваемости кишечным дисбиозом (дисбактериозом), который является источником острых эндогенных инфекций (перитонит, аппендицит, холецистит, пиелонефрит, пневмония), способствует развитию аллергических заболеваний, формированию и прогрессированию хронических воспалительных процессов в различных органах. Микрофлора кишечника при кишечном дисбиозе играет роль в канцерогенезе, развитии атеросклероза, является источником генов антибиотикорезистентности, способных передаваться другим бактериям.

В связи с высокой распространенностью кишечного дисбиоза вопрос своевременного его распознавания становится одной из задач диагностической службы. Для выявления кишечного дисбиоза, как известно, применяется расширенное бактериологическое исследование фекалий классическим способом с определением количества и биологических свойств анаэробной микрофлоры (Эпштейн-Литвак Р. В. и др. Бактериологическая диагностика дисбактериоза кишечника: Методические рекомендации. М. 1977). Чрезвычайное многообразие кишечной микрофлоры (в содержимом слепой кишки находятся представители 17 семейств, 45 родов и свыше 400 различных видов) требует большого набора питательных сред и создания особых условий культивирования микроорганизмов. Это приводит к тому, что лабораторные методы диагностики дисбиоза кишечника до настоящего времени остаются дорогостоящими, трудоемкими, длительными и неприемлемыми для проведения массовых исследований.

На основании вышеизложенного можно сделать вывод о важности раннего выявления кишечного дисбиоза для своевременного и эффективного проведения коррекции микрофлоры био- и иммунопрепаратами. Для решения такой задачи требуются программы по скринингу населения на предмет кишечного дисбиоза.

Поскольку при нарушении кишечного биоценоза все свойства, микрофлоры (антагонистическая и витаминообразующая активность, участие в метаболических процессах и др. ) значительно изменяются, предложены различные косвенные тесты диагностики кишечного дисбиоза. Так, о состоянии микробиоценоза судят по уровню метаболитов кишечной микрофлоры. С этой целью определяют индикан, п-крезол и фенол в моче; водород и метан в выдыхаемом воздухе; летучие жирные кислоты в содержимом тощей кишки или в фекалиях; аммиак в крови, в кале или в выдыхаемом воздухе (Тамм А.О. и др. Метаболиты кишечной микрофлоры в диагностике дисбиоза кишечника. Антибиотики и медицинская биотехнология. 1987, т. 32, N 3, с.191-195). Методы выявления кишечного дисбиоза, основанные на обнаружении продуктов метаболизма, дают удовлетворительные результаты при выраженном дисбалансе кишечной микрофлоры и имеют малую чувствительность и диагностическую ценность в начальной стадии кишечного дисбиоза (там же, с. 192). Следовательно, эти методы недостаточны для проведения скрининговых исследований населения на дисбиоз кишечника. В основу другого метода выявления дисбиотических нарушений положена степень антагонистической активности микроорганизмов, выделенных из фекалий (Завгородняя Е.Ф. и др. Антагонистическая активность кишечной аутофлоры как косвенный метод выявления дисбактериоза кишечника. Врачебное дело. 1981, N 6, с.113-116). Недостатком данного метода оценки состояния кишечника микрофлоры является длительность исследования (5 сут).

В связи с изложенными выше обстоятельствами поиск новых методов скрининговой диагностики кишечного дисбиоза является актуальной задачей клинической микробиологии. При проведении массовых обследований населения, особенно детского, на выявление дисбиоза кишечника немаловажное значение имеет дифференцирование последнего со спорадическими случаями кишечных инфекций. В настоящее время отсутствуют четкие клинические и микробиологические критерии дифференциации этих двух заболеваний. Существующие лабораторные методы диагностики кишечных инфекций, вызванных условно-патогенными энтеробактериями (УПЭ) эшерихиями, протеями, клебсиеллами и др. основаны на обнаружении их в количестве не менее 10⁶ КОЕ в 1 г фекалий, оценке их биологических свойств, наличии антител к условно-патогенным энтеробактериям в титре 1:40 и выше с нарастанием их уровня в динамике заболевания при исследовании "парных" сывороток (Королева Л. Б. и др. Клиника, диагностика, лечение, эпидемиология и противоэпидемические мероприятия при острых кишечных инфекциях, вызванных условно-патогенными бактериями у детей раннего возраста: Методические рекомендации, М. 1988, с.19). Дороговизна, трудоемкость, длительность исследований исключает возможность использования перечисленных методов диагностики кишечных инфекций, вызванных УПЭ, для проведения скрининговых исследований. Следовательно, особую активность приобретает разработка метода бактериологического скрининга, позволяющего на первом этапе обследования (поисковая программа) выявлять и проводить дифференциальный диагноз наиболее распространенных инфекционных заболеваний кишечника кишечного дисбиоза и кишечной инфекции, вызванных условно-патогенными бактериями.

Наиболее близким техническим решением, выбранным в качестве прототипа, является способ определения кишечного дисбиоза по дефициту бифидобактерий (посев взвеси фекалий производится в среду Блаурокка; учет путем микроскопии окрашенных по Граму мазков, приготовленных из характерных колоний) и обнаружению тканевого белка в кале (осаждение растворимого белка путем добавления трихлоруксусной кислоты к эмульсии из фекалий; учет визуальная регистрация степени просветвления надосадочной жидкости), указывающего на возможное повреждение клеточных элементов кишечной стенки (Дорофейчук В.Г. и др. Ключевые тесты для определения кишечного дисбактериоза: Пристендовый листок ВДНХ СССР. М. 1991). Недостатком известного способа является отсутствие возможности диагностики дисбиоза кишечника на ранней стадии, характеризующейся лишь незначительными изменениями в аэробной части микробиоценоза (увеличение или уменьшение количества кишечной палочки при отсутствии снижения уровня бифидобактерий 1 степень дисбиоза) (Грачева Н.М. и др. Применение бактерийных биологических препаратов в практике лечения больных кишечными инфекциями. Диагностика и лечение дисбактериоза кишечника: Методические рекомендации. М. 1986, с. 16-17). Кроме того, визуальная оценка ("полное", "значительное", "незначительное" просветвление жидкости) не позволяет объективно оценить и стандартизировать результаты.

Изложенная выше обобщенная характеристика выявленных способов-аналогов с указанием причин, препятствующих получению требуемого технического результата, дает основание сделать вывод, что заявляемое изобретение не известно из уровня техники, т.е. является новым.

Существенные отличия заключаются в том, что определяют антиинтерфероновую активность одномоментно у всех колоний энтеробактерий в посеве фекалий на питательном агаре с препаратом человеческого лейкоцитарного интерферона в концентрации 2 МБК для тест-культуры Corinebacterium xerosis ГИСК N 181 и при инактивации интерферона колониями делают заключение о состоянии кишечного микробиоценоза: отсутствие антиинтерфероновой активности у выросших колоний свидетельствует об эубиозе; обнаружение признака у 1-50% колоний указывает на кишечный дисбиоз, а наличие признака у более 50% колоний на кишечную инфекцию.

Авторы полагают, что существенные отличия являются новыми и дают возможность осуществлять раннюю диагностику кишечного дисбиоза и кишечной инфекции за счет сокращения сроков и повышения информативности исследования путем предварительной ориентировочной оценки состояния кишечной микрофлоры. Заявляемый способ может быть использован как для выполнения массового скрининга с целью определения групп риска, так и для проведения дифференциального диагноза различных состояний микробиоценоза кишечника в сложных клинико-бактериологических ситуациях.

Способ осуществляют следующим образом.

Ректальной петлей производят посев содержимого прямой кишки на чашки Петри с 1,5% мясо-пептонным агаром, содержащим препарат человеческого лейкоцитарного интерферона (НПО "Иммунопрепарат", г. Уфа) в количестве 0,3 мл рабочего раствора в 7,5 мл агара, что соответствует концентрации 2 МБК для тест-культуры Corynebacterium xerosis ГИСК N 181. Рабочий раствор готовится согласно инструкции растворенного вещества ампулы в 2 мл стерильного 0,85% раствора хлорида натрия. Одновременно на одну чашку допускается посев кала по секторам от двух-трех обследуемых. Посевы инкубируют в термостате 18-24 ч при 37^oC. Выросшие колонии убирают парами хлороформа. Для этого, держа чашку перевернутой, вкладывают в ее крышку кусочек бумаги ватман площадью 8-10 см² и пропитывают его 0,3-0,5 мл хлороформа. Держат чашку закрытой 20-30 мин. Переворачивают чашку и сверху на колонии наслаивают 3-4 мл мягкого (0,6-0,7% ) агара, смешанного с 0,1 мл взвеси (в 1 мл около 10⁹ индикаторных клеток по оптическому стандарту мутности) суточной агарной тест-культуры Corynebacterium xerosis ГИСК N 181.

Результат учитывают через 18-24 ч инкубации в термостате при 37^o C, т.е. через двое суток от начала исследования. По окончании срока инкубации определяют антиинтерфероновую активность в посеве фекалий, по росту тест-штамма на поверхности и вокруг колоний, что свидетельствует о неблагополучии в кишечном микробиоценозе. Обнаружение антиинтерфероновой активности у 1-50% выросших колоний свидетельствует о кишечном дисбиозе; наличие признака у более 50% колоний указывает на кишечную инфекцию, а отсутствие признака на эубиоз.

На основании результатов обследования детей и взрослых по поисковой программе подозрение на кишечный дисбиоз или кишечную инфекцию по количеству антиинтерферонактивных колоний можно считать подтвержденным. Основная программа, применяемая на втором этапе диагностического поиска как дополнение к поисковой, требует развернутого бактериологического исследования фекалий с целью уточнения вида и степени дисбиоза кишечника, вида (эшерихиоз, клебсиеллез и др.) кишечной инфекции и решения вопроса о методах их коррекции.

Теоретической предпосылкой к разработке предлагаемого способа выявления кишечного дисбиоза и кишечной инфекции послужили обнаруженные нами различия в количестве антиинтерферонактивных колоний на чашках с посевами фекалий у здоровых и больных с кишечными дисфункциями (табл. 1).

Так, при посеве фекалий от 30 больных с кишечной инфекцией, вызванной ЭПКП 0,18, нетипируемыми эшерихиями, клебсиеллой, протеем и другими энтеробактериями, в 28 случаях (93,3%) обнаружены антиинтерферонактивные колонии. Для больных этой группы оказалось характерным наличие антиинтерфероновой активности у большинства (80-100%) выросших колоний.

При посеве испаражнений от 100 больных кишечных дисбиозом положительные результаты антиинтерферонового теста были выявлены с такой же частотой (87% больных), как и при кишечных инфекциях. Однако, на долю антиинтерфероактивных приходилось от 1 до 50% колоний, то есть менее половины выросших на чашке.

При обследовании 30 клинически и бактериологически здоровых детей и взрослых в 27 случаях (90%) в посеве фекалий не было обнаружено колоний, инактивирующих интерферон. Лишь у 3 из 30 обследованных выявлен положительный антиинтерфероновый тест, при этом количество активных колоний составило 3-5% от числа выросших.

Используя описанный выше метод, было проведено скрининговое исследование 140 детей детского соматического стационара СМЧ ПО "Стрела" г. Оренбурга по поводу затяжной кишечной дисфункции. Результаты исследования приведены в табл. 2.

При использовании критериев заявленного способа (наличие антиинтерфероновой активности у 1-50% колоний) положительный результат скрининга на кишечный дисбиоз выявлен в 22 случаях из 180 (12,2%), в то время как способом-прототипом (обнаружение тканевого белка в кале при отсутствии бифидобактерий) в 10 случаях (5,6%), P<0,05.

Аналогичные данные получены и в отношении диагностической значимости скринингового исследования фекалий на кишечную инфекцию: антиинтерфероновый тест (наличие активности у более чем 50% колоний) оказалось положительным в 13 из 180 случаев (7,2%) против 9 случаев (5%), выявленных способом-прототипом.

В группе детей с дисбиозом кишечника положительные результаты скрининга были подтверждены развернутым бактериологическим исследованием фекалий по методике Р.В. Эпштейн-Литвак и Ф.Л. Вильшанской (1977).

У больных с положительным скрининг-тестом на кишечную инфекцию диагноз был подтвержден бактериологическим методом (выявление УПЭ в чистой культуре из разведения фекалий 10^-5, что соответствует их количеству более 10⁶ КОЕ в 1 г), а также положительным иммунным ответом макроорганизма - наличием сывороточных антител к УПЭ в титре 1:160 и выше.

Способ был использован для обследования трех групп детей: первая - больные с кишечным дисбиозом; вторая больные с кишечными инфекциями; третья контрольная. Приводим конкретные примеры.

Первая группа детей (больные с дисбизом кишечника).

Пример 1. Больная З. 10 лет. Диагноз при поступлении хронический пиелонефрит эшерихиозной этиологии в стадии обострения. При проведении скрининга по предлагаемому способу обнаружен кишечный дисбиоз (количество антиинтерферонактивных колоний при посеве фекалий составило 15%), в то время как параллельно проведенное исследование кала по прототипу дисбиотических явлений не выявило. В ходе дальнейшего общепринятым методом подтверждено нарушение кишечного микробиоценоза в виде увеличения общего количества кишечной палочки (4,6 • 10⁹ КОЕ/г) c появлением гемолитических и лактозонегативных форм (соответственно 8 и 20%), а также снижение бифидофлоры (10⁷ КОЕ/г). Проведена целенаправленная коррекция микрофлоры кишечника биопрепаратами. Следовательно, у больного предлагаемым методом выявлен дисбиоз кишечника на раннем этапе обследования, что позволило своевременно провести коррекцию возникших нарушений и уменьшить число рецидивов пиелонефрита.

Пример 2. Больной Р. 8 лет. Страдает экземой с трехлетнего возраста. При бактериологическом исследовании фекалий предлагаемым методом выявлено 30% колоний, инактивирующих интерферон. Характер выявленных дисбиотических нарушений установлен в дальнейшем путем развернутого анализа в виде дефицита бифидобактерий (10⁵ КОЕ/г) и эшерихий (10⁶ КОЕ/г), увеличения содержания УПЭ клебсиелл (10⁷ КОЕ/г).

Вторая группа больных (больные с кишечными инфекциями).

Пример 1. Больной М. 2 мес. Из анамнеза известно, что ребенок приложен к груди на третьи сутки после рождения (послеродовое кровотечение у матери). После выписки из роддома стул учащен до 8-10 раз со слизью. Вскармливание естественное. Отстает в массе (прибавка за 1 месяц 850 г, за второй 300 г). При осмотре выявлен признаки гипотрофии 1 степени. Стул 2-3 раза в день, жидкий, без патологических примесей. Антибиотиками не лечился. При исследовании фекалий по предлагаемому способу, проведенному при поступлении, выявлена антиинтерфероновая активность у 100% колоний в посеве фекалий на питательном агаре с лейкоцитарным интерфероном, что свидетельствует о кишечной инфекции. При дальнейшем клиническом и бактериологическом обследовании подтверждено наличие эшерихиозной кишечной инфекции: выявлена энтерпатогенная кишечная палочка серогруппы 018 в количестве 6,3•10⁹ КОЕ/г со слабо выраженными ферментативными свойствами. Целенаправленная антибиотикотерапия в комплексе с патогенетическими средствами привела к положительному эффекту.

Пример 2. Больной Г. 7 лет. Жалобы на субфебрилитет, жидкий стул в течение двух дней после употребления сухофруктов. В ходе клинико-лабораторного обследования по предлагаемому способу через двое суток после поступления установлена кишечная инфекция, что обосновано наличием в посеве фекалий у 80% колоний способности инактивировать интерферон. Последующие обследования выявило нетипируемые эшерихии в количестве 2,1•10⁹ КОЕ/г, гемолитически неактивные, и четырехкратное нарастание титра антител к аутоштамму кишечной палочки на второй неделе заболевания.

Третья группа детей (контрольная).

Пример 1. Ребенок А. 5 лет. Диагноз при поступлении энурез. При проведении скрининга на неблагополучие в кишечной микробиоценозе получен отрицательный результат антиинтерферонактивных колоний в посеве фекалий не обнаружено. Эубиоз подтвержден развернутым бактериологическим анализом.

Пример 2. Мальчик О. 6 лет. В возрасте 5 лет оперирован по поводу стеноза прилоханочного отдела мочеточника. Послеоперационный период осложнился синегнойной инфекцией мочевых путей. В поисках источника инфицирования мочевого тракта произведено исследование фекалий по предлагаемому способу. Получен отрицательный результат. При бактериологическом исследовании фекалий подтвержден эубиоз. Инфицирование мочевых путей синегнойной палочкой явилось следствием внутрибольничного инфицирования. Применение синегнойного фага привело к санации мочевых путей.

Таким образом, проведенные микробиологические исследования и клинические испытания показали, что предлагаемый способ обладает следующими достоинствами: прост в испытании, доступный, неинвазивный, не требует специальных средств и оборудования, по сравнению с прототипом повышает точность диагностики вдвое, на одни сутки сокращает сроки исследования. Возможность проведения повторных, даже ежедневных анализов также является преимуществом способа.

Способ выявления кишечного дисбиоза и кишечной инфекции. Использование: в области медицинской микробиологии, а именно в лабораторной диагностике нарушений микробиоценоза кишечника. Сущность изобретения: обнаруживают у выросших на питательном агаре при посеве фекалий колоний энтеробактерий способность инактивировать коммерческий препарат человеческого лейкоцитарного интерферона в концентрации 2 МБК для тест-культуры Corynebacterium xerosis ГИСК N 181. При этом отсутствие антиинтерфероновой активности у выросших колоний свидетельствует об эубиозе; обнаружение признака у 1-50% колоний указывает на кишечный дисбиоз, а наличие признака у более 50% колоний - на кишечную инфекцию. Способ дает возможность осуществлять раннюю диагностику кишечного дисбиоза и кишечной инфекции за счет сокращения сроков и повышения информативности исследований путем предварительной ориентировочной оценки состояния кишечной микрофлоры. Способ может быть использован как для выполнения массового скрининга с целью определения групп риска, так и для проведения дифференциального диагноза различных состояний микробиоценоза кишечника в сложных клинико-бактериологических ситуациях. 2 табл.

Способ выявления кишечного дисбиоза и кишечной инфекции путем посева исследуемого материала на питательную среду, отличающийся тем, что определяют антиинтерфероновую активность одномоментно у всех колоний энтеробактерий в посеве фекалий на питательном агаре с препаратом человеческого лейкоцитарного интерферона в концентрации 2 МБК для тест-культуры Corynebacterium xerosis ГИСК N 181 и при инактивации интерферона колониями делают заключение о состоянии кишечного микробиоценоза: отсутствие антиинтерфероновой активности у выросших колоний свидетельствуют об эубиозе; обнаружение признака у 1 50% колоний указывает на кишечной дисбиоз, а наличие признака у более 50% колоний на кишечную инфекцию.