СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИСЫВОРОТКИ К ТРАНСТИРЕТИНУ ЧЕЛОВЕКА Российский патент 1998 года по МПК A61K39/395 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при создании тест-системы для количественного определения транстиретина человека в биологических жидкостях.

Транстиретин (ТТР) является полифункциональным белком, выполняющим важную роль в метаболизме витамина A, тиреоидных гормонов и иммунном ответе. В клинической практике определение концентрации ТТР в крови и других биологических жидкостях имеет диагностическую значимость при амилоидозе, заболеваниях печени, новообразованиях различной локализации, травмах, ожогах, воспалительных процессах. Кроме того, исследование уровня ТТР в плазме крови является наиболее чувствительным критерием для оценки белково-энергетической недостаточности, сопровождающей критические состояния.

Содержания ТТР в биологических жидкостях определяют иммунохимическими методами. Одним из важных этапов создания тест-системы к ТТР является получение антисыворотки к данному белку.

Известен способ получения антисыворотки к ТТР человека, включающий многократную иммунизацию кроликов в течение 5-7 недель очищенным антигеном (ТТР), смешанным с адъювантом Фрейнда. Общая доза вводимого ТТР варьировала от 3,0 до 4,5 мг [1]. Однако этот способ имеет ряд недостатков:
многократность введения антигена (3-5 раз);
длительность цикла иммунизации животных 35-45 дней;
высокая антигенная нагрузка на животное, приводящая к толерантности.

Задачей изобретения является повышение иммуногенности ТТР человека и сокращение сроков иммунизации животных.

Поставленная задача решается тем, что при получении антисыворотки к ТТР человека путем иммунизации животных внутрикожно специфическим антигеном в смеси с адъювантом Фрейнда и в дальнейшем забором крови, в качестве антигена используется полимер-ТТР с содержанием полимерных форм 15-25 мас.%, которые получали путем обработки ТТР глутаровым альдегидом в конечной концентрации 2-8 ммоль при pH 7,0-7,4, а иммунизацию кроликов осуществляли двукратно в дозе 0,6-1,2 мг с интервалом 14 дней.

Для получения препарата ТТР, обогащенного полимерными формами ТТР (полимер-ТТР), в раствор ТТР с концентрацией 3-6 мг/мл по белку в забуференном физ. растворе -ЗФР-(хлорид натрия 8 г, фосфат натрия двухзамещенный 2,9 г, фосфат калия однозамещенный 0,2 г, хлорид калия 0,2 г и дистиллированной воды до 100 мл, pH 7,0-7,4) добавляют по каплям раствор глутарового альдегида до его конечной концентрации 2 - 8 ммоль, постоянно перемешивая при 37^oC в течение 12 ч.

Препарат полимер-ТТР представляет собой смесь тетрамерных и полимерных форм белка. Причем оптимальное содержание полимерных форм в препаратах составляет 15-25%, что позволяет получить эффективный иммуный ответ. Посредством иммунохимического анализа доказано, что полученный препарат (полимер-ТТР) содержит антигенные детерминанты, аналогичные исходному ТТР, а молекулярная масса увеличивается в 2-3 раза.

Получение полимер-ТТР иллюстрируется следующим образом.

Пример 1. К 1 мл раствора ТТР (концентрация 3,25 мг/мл) в ЗФР (pH 7,0) добавляли по каплям при перемешивании 0,4 мл 0,1%-ного раствора глутарового альдегида. Смесь оставляют при 37^oC на 12 ч. Конечная концентрация глутарового альдегида 2,8 ммоль. Полимерная форма ТТР составляет 15 мас.%.

Пример 1. К 1 мл раствора ТР (концентрация 4,0 мг/мл) в ЗФР (pH 7,4) добавляют по каплям при перемешивании 0,6 мл 0,1%-ного раствора глутарового альдегида. Смесь оставляют при 37^oC на 12 ч. Конечная концентрация глутарового альдегида 3,7 ммоль. Полимерная форма ТТР составляет 20 мас.%.

Пример 3. К 1 мл раствора ТТР (концентрация 6,0 мг/мл) в ЗФР (pH 7,2) добавляют по каплям при перемешивании 0,8 мл 0,1%-ного раствора глутарового альдегида. Смесь оставляют при 37^oC на 12 ч. Конечная концентрация глутарового альдегида 7,4 ммоль. Полимерная форма ТТР составляет 25 мас.%.

Препарат ТТР, обогащенный полимерными формами (полимер-ТТР), использовался для получения антисыворотки. Иммунизация кроликов осуществляется следующим образом: препарат полимер-ТТР (0,06-1,2 мг по белку) смешивают с равным объемом полного адъюванта Фрейнда и вводят кроликам внутрикожно в 8-10 точек вдоль позвоночника. Через 14 дней проводят забор крови из ушной вены.

Иммунохимический анализ полученных антисывороток к полимер-ТТР по Оухтерлони антисыворотки к полимер-ТТР человека показал ее специфичность стандартному ТТР (формы "Sigma", США) и идентичность с моноспецифической антисывороткой к ТТР (фирмы "Sigma", США).

Способ иммунизации поясняется следующими примерами.

Пример 1. Кролику (порода "Шиншилла") весом 3,5 кг внутрикожно в 10 точек вдоль позвоночника вводили смесь 0,9 мг полимер-ТТР+0,3 мл полного адъюванта Фрейнда. Через 14 дней осуществляли забор крови кролика. Иммунохимический анализ показал наличие антител к ТТР человека в концентрации 0,7 мг/мл.

Пример 2. Кролику (порода "Шиншилла") весом 3 кг внутрикожно в 8 точек вдоль позвоночника вводили смесь 0,9 мг полимер-ТТР+0,3 мл полного адъюванта Фрейнда. Через 14 дней вводили смесь 0,3 мг полимер-ТТР + 0,3 мл адъюванта Фрейнда. Через 14 дней осуществляли забор крови животного. Иммунохимический анализ показал наличие антител к ТТР человека в концентрации 0,9 мг/мл.

Сравнительный анализ иммунизации кроликов препаратами ТТР и полимер-ТТР показал
при иммунизации животных очищенным ТТР на одну инъекцию необходимо 3,0-4,5 мг белка, а полимер-ТТР - 0,6-1,2 мг;
весь цикл иммунизации очищенным ТТР составил 42-45 дней, а полимер-ТТР- 14-28 дней;
Таким образом, иммунизация препаратом полимер-ТТР позволила получить антисыворотки, содержащие антитела к ТТР человека.

Использование: в медицине, иммунологии, в производстве иммунодиагностикумов. Сущность изобретения: иммунизацию кроликов осуществляют двукратно, внутрикожно, с интервалом 14 дней специфическим антигеном - препаратом полимер-транстиретин с содержанием полимерных форм 15 - 25 мас.% в смеси с адъювантом Фрейнда инъекционной дозой с содержанием препарата 0,6 - 1,2 мг. Препарат полимер-транстиретин получают обработкой раствора транстиретина с концентрацией белка 3 - 6 мг/мл глутаровым альдегидом в конечной концентрации 2 - 8 ммоль/л при pH 7,0 - 7,4. Способ позволяет повысить иммуногенность транстиретина человека и сократить сроки иммунизации животных.

Способ получения антисыворотки к транстиретину человека путем иммунизации кроликов внутрикожно специфическим антигеном в смеси с адъювантом Фрейнда и забора крови, отличающийся тем, что в качестве специфического антигена используют препарат полимер-транстиретин с содержанием полимерных форм 15 - 25 мас.%, полученный обработкой раствора транстиретина с концентрацией белка 3 - 6 мг/мл глутаровым альдегидом в конечной концентрации 2 - 8 ммоль/л при pH 7,0 - 7,4, а иммунизацию кроликов осуществляют двукратно с интервалом 14 дней инъекционной дозой с содержанием препарата полимер-транстиретина 0,6 - 1,2 мг.