СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЛЬФА-МАКРОГЛОБУЛИНА Российский патент 1995 года по МПК A61K35/16 

Изобретение относится к биологической химии, а точнее к биотехнологии, и может быть использовано для выделения альфа₂-макроглолубина белка, синтезирующегося гепатоцитами, обладающего активностью протеиназ и иммуносупрессора, имеющего отношение к регуляции воспалительных процессов различной природы.

Альфа₂-макроглоубин является необходимым компонентом иммунодиагностикумов, используемых для оценки воспалительных процессов и способности организма освобождаться от избытка экзо- и эндогенных протеиназ.

Известно несколько принципиально различных способов очистки альфа₂-макроглобулина (МГ), но наиболее эффективны методы, основанные на метал-хелатной хроматографии. Первый из них заключается в осаждении целевого продукта сульфатом аммония (40-55% насыщения), диализе и цинк-хелатной аффинной хроматографии с удалением примесей 0,02М натрий-фосфатным буфером, рН 6,0, а затем элюировании МГ 0,02М какодилатным буфером, рН 5,0.

Однако этот способ отличается большой длительностью, относительно низким выходом искомого белка, наличием примесей и значительным снижением биологической активности МГ. Наиболее близким решением является способ получения МГ из плазмы крови путем удаления плазминогена экстракцией лизин-сефарозой при рН 7,4, осаждением полиэтиленгликолем с мол.мас.6000 Д в диапазоне концентраций последнего от 6 до 16% диализом, анионообменной хроматографией на ДЕАЕ-сефадексе при рН 7,0 градиентом концентраций хлористого натрия (0,05-0,5М) и цинк-хелатной аффинной хроматографией на иминодиуксуснокислой сефарозе градиентом рН от 7,0 до 5,0. Указанный способ использован в качестве прототипа.

Недостатком его является многоэтапность, а также снижение иммуногенности МГ и его активности по отношению к протеиназам из-за длительной процедуры очистки.

Целью изобретения является сокращение времени получения целевого продукта путем устранения промежуточных этапов очистки, повышение степени его чистоты и иммуногенности.

Поставленная цель достигается непосредственным извлечением белка из плазмы крови при помощи цинкового производного иминодиуксуснокислой агарозы и дополнительно осуществляется гель-хроматографией на колонке 8% поперечно-сшитой агарозы и лиофилизации.

Препарат МГ, очищенный описанным способом, давал одну линию (трек) при электрофорезе в градиенте пор полиакриламидного геля. Одна полоса наблюдалась и при электрофорезе в тех же условиях с додецилсульфатом натрия. Мол. мас. белка 720 кД (гель-хроматография, электрофорез в градиенте пор полиакриламидного геля). Белок состоит из 4 идентичных субъединиц с мол.м. 180 кД (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия). Его Р1 соответствует 4,7 (изофокусировка с амфолинами в агарозе и полиакриламидном геле, а также в борат-полиольной системе). Аминокислотный и углеводный состав соответствует литературным данным. Белок угнетает протеиназную активность трипсина, химотрипсина, плазмина, субтилизина, пепсина, папаина, клостридиопептидазы А (коллагеназы) и протеиназы К. Полученный препарат связывает указанные ферменты в отношении 0,5-2 М/М. Под действием ферментов и первичных аминов претерпевает конформационное превращение с экспрессией 4 внутренних тиоэфиров. При иммунизации овец, кроликов и морских свинок течение 1 года во всех случаях продуцируется моноспецифическая антисыворотка. Очищенный препарат МГ образовывал одну полосу преципитации с козьими, бараньими и кроличьими антисыворотками против белков сыворотки крови человека, но не реагировал с моноспецифическими антисыворотками против плазминогена, тромбина, фибриногена, компонентов системы комплемента, орозомукоида, иммуноглобулинов, аполипопротеина, трансферрина, гаптоглобина, церулоплазмина, альфа-антиплазмина, альфа-ингибитора протеиназ, альфа₁-фетопротеина, ассоциированного с беременностью протеина А и ассоциированного с беременностью альфа₂-гликопротеина. При использовании тест-систем на МГ фирм "Беринг" (ФРГ) и "Севак" (Чехословакия) полученные препараты белка и антисыворотки против него демонстрировали реакцию полной иммунохимической идентичности. Таким образом, очищенный предлагаемым способом белок полностью отвечал требованиям к идентичности, гомогенности и нативности. Выход его составлял 1,1 г/л плазмы крови с чистотой 95% Полученный препарат и антисыворотки против него использовали для конструирования стандартных тест-систем. Кроме того, моноспецифические антисыворотки против МГ были использованы для выделения аффинно очищенных антител к этому белку, пригодных для иммуноферментного анализа. В этом случае сорбент для очистки указанных антител готовился путем иммобилизации очищенного препарата МГ на нерастворимой матрице (агарозе). Данные продукты биотехнологии могут быть использованы для обнаружения и количественного определения МГ в биологическом материале.

Новым в предложенном методе является прямое извлечение МГ из плазмы крови при помощи иминодиуксуснокислой агарозы в цинковой форме. Прототип на предшествующих этапах основан на удалении плазмина лизин-сефарозой, осаждении полиэтиленгликолем 6000 (4-16%) и анионообменной хроматографии. Установлено, что лизин-сефароза связывает до 20% МГ за счет неспецифических взаимодействий. Полиэтиленгликоль не удается полностью удалить при диализе. Некоторые потери МГ (до 10%) наблюдаются и при анионообменной хроматографии.

МГ обладает высоким аффинитетом к цинковым производным иминодиуксуснокислой агарозы, поэтому предыдущие этапы могут быть опущены. Фиксированный же белок может быть освобожден от большей части примесей градиентом рН от 7,0 до 5,0. Однако продукт, полученный по способу прототипа или путем прямого извлечения из плазмы крови при помощи цинк-хелатной хроматографии, содержит примеси. Однако высокая мол.мас. МГ позволяет избавиться от них при помощи хорошо известного метода гель-хроматографии. Таким образом, использование в заявляемом способе очистки МГ сочетания известных методов металл-хелатной и гель-хроматографии позволяет достичь нового качества быстрого получения целевого продукта с высоким его выходом, степенью чистоты и сохранением биологической активности.

П р и м е р 1. Плазма крови (100 мл) смешивается с 50 мл 6% иминодиуксуснокислой агарозы в цинковой форме. Смесь встряхивается 4 ч при комнатной температуре. Осадок отмывается декантацией 0,02М натрий-фосфатным буфером с рН 7,0, содержащим 1 М хлористого натрия, до отсутствия следов белка в промывных водах. Большая часть примесей удаляется промывкой аналогичным буфером с рН 6,0. Целевой продукт экстрагируется двумя порциями (по 50 мл) 0,02М натрий-фосфатного буфера с рН 5,0, содержащего 1 М хлористого натрия. Полученный экстракт концентрируется и подвергается гель-хроматографии на колонке (5 х 90 см) 6% поперечно-сшитой агарозы (сефарозы 6В). Целевой продукт элюируется в первых фракциях и детектируется по способности угнетать активность ферментов или при помощи моноспецифической антисыворотки. Очищенный продукт диализуется против 0,05 М раствора бикарбоната аммония и лиофилизируется. Выход препарата составляет 0,6 г из 1 л плазмы крови (22%) с чистотой 95% по результатам электрофореза и иммунохимического анализа.

П р и м е р 2. То же количество плазмы разводится в 10 раз 0,02 М натрий-фосфатным буфером с рН 8,0, содержащим 1 М хлористого натрия. Раствор пропускается через колонку (2,5 х 10 см) 6% иминодиуксуснокислой агарозы в цинковой форме, уравновешенной тем же буфером, со скоростью 200-300 мл/ч. Большая часть примесей удаляется промывкой колонки 0,02М натрий-фосфатным буфером с рН 6,0, содержащим 1 М хлористого натрия. Целевой продукт элюируется 0,02М натрий-фосфатным буфером с рН 5,0, содержащим 1 М хлористого натрия, и детектируется иммунохимически или по биологической активности. Дальнейшая очистка как в примере 1. Выход препарата достигает 1 г из 1 л плазмы крови (38%) с чистотой 95%
П р и м е р 3. То же количество плазмы крови разводится в 5 раз 0,02М натрий-фосфатным буфером с рН 8,0, содержащим 1 М хлористого натрия, а затем встряхивается с 50 мл 4% иминодиуксуснокислой агарозы, уравновешенной тем же буфером, в течение 2 ч. Смесь набивается в колонку (2,5 х 10 см). Колонка элюируется линейным градиентом 0,02М натрий-фосфатных буферов с рН 7,0 и 5,0, содержащих 1 М хлористого натрия. Выход МГ регистрируется иммунохимически или по биологической активности. Дальнейшая очистка как в примере 1. Выход препарата составляет 1,1 г из 1 л плазмы крови с чистотой 95%
Полученные препараты использованы для иммунизации животных. В результате получены антисыворотки, содержащие до 1 мг/мл моноспецифических антител. Препарат, полученный по способу прототипа, не позволял получать моноспецифические антисыворотки из-за наличия иммуногенных примесей.

Таким образом, предложен способ выделения уже известного и хорошо апробированного как в нашей стране, так и за рубежом альфа₂-макроглоубина. Предложенный способ реализует следующие преимущества по сравнению с прототипом: очистка сокращается на три этапа (исключаются этапы обработки плазмы крови лизин-агарозой, осаждения полиэтиленгликолем 6000 и анионообменной хроматографии); степень чистоты и нативность препарата позволяют использовать его для получения моноспецифических антисывороток, не требующих адсорбции; белок пригоден для получения аффинных антител из моноспецифических антисывороток, отвечающих необходимым требованиям для проведения иммуноферментного и других видов иммунохимического анализа; расходы на получение высокоочищенного препарата сокращаются на 40% технология очистки позволяет перерабатывать значительные количества исходного сырья с получением свыше 1 г белка из одного литра нативной плазмы крови; отходы производства препарата сохраняют биологическую активность других белков плазмы крови и могут быть утилизированы для производства иных препаратов фракционирования плазмы крови.

Изобретение относится к биологической химии, а точнее к биотехнологии. Цель изобретения сокращение времени получения целевого продукта путем устранения промежуточных этапов очистки, повышения его чистоты и иммуногенности. Способ получения альфа-2-макроглобулина из биологического сырья основан на использовании цинк-хелатной хроматографии. Новым в способе является непосредственное извлечение белка из плазмы крови при помощи цинкового производного иминодиуксуснокислой агарозы с дополнительной гель-хроматографией на колонке 6% поперечно-сшитой агарозы и лиофилизации.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЛЬФА-МАКРОГЛОБУЛИНА из плазмы крови путем экстракции, цинк-хелатной хроматографии рН 7,0 5,0 с последующей элюцией диализом и лифилизацией целевого продукта, отличающийся тем, что экстракцию проводят имминодиуксусной агарозой, и экстракт подвергают гель-хроматографии на колонке 6% поперечно-сшитой агарозы.