СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИЧНОСТИ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ВОЗДЕЙСТВИЙ НА ОРГАНИЗМ Российский патент 1997 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, биологии.

Влияние негативных факторов среды на организм сопровождается многогранными изменениями состояния здоровья, профилактика которых возможна только при наличии методов донозологической диагностики.

Существующие методы клинико-лабораторной диагностики имеют преимущественно инвазивный характер (анализ крови), поэтому их использование ограничено клиническими условиями при наличии службы стерилизации и контроля. При диспансерном обследовании больших контингентов населения актуально использование специфических методик, материалами для которых служат волосы, слюна, моча. В последних, с одной стороны, накапливаются и выводятся попавшие в организм токсические вещества и, с другой, происходят изменения биологических констант, выраженность которых отражает функциональное состояние человека (Г. К. Гуринович и др. Терапевтический архив, 1991, 7, с. 47-49). Однако их получение и транспортировка для анализа имеет определенные организационные трудности.

Одним из наиболее перспективных объектов для проведения скрининговых лабораторных обследований, лишенных перечисленных недостатков, являются буквально мазки. Эпителиальные ткани являются ведущим биобарьером организма, который предохраняет его от окружающей среды и их морфофункциональные параметры демонстрируют как выраженность реакций на внешние условия, так и исходное функциональное состояние организма. На этой закономерности разработан текст определения соответствия биологического и паспортного возраста, когда по подсчету процента электроотрицательных ядер в клетках буккального эпителия в мазке определяют превалирование в организме пролиферации или деструкции с учетом возрастных данных.

К недостаткам способа относится полуколичественный характер оценки функционального состояния эпителия, в зависимости от геронтологических изменений: а также возможность искажения регистрируемых показателей случайными влияниями (курение накануне обследования, применение в пище местнораздражающих веществ). Метод позволяет проводить исследования в диапазоне 4-60 лет (В.Г. Шахбазов и др. Лабораторное дело, 1986, 10, с. 24-27).

Прототипом настоящего изобретения является способ определения токсичности вещества, в котором текст-объектом являются клетки буккального эпителия женщин и по уменьшению в них содержания полового хроматина, по сравнению с контролем, судят о токсичности вещества, наносимого пипеткой на препарат мазка. Его целью является повышение точности, чувствительности определения и возможность экстраполяции полученных данных на организм человека (авт.св. N 1097947, В.Л.Дышловой и др. 1985).

К недостаткам прототипа относится:
1. Использование в качестве индикатора реакции полового хроматина, регистрируемого полуколичественным способом (подсчет), ограничивает универсальность метода и делает возможным его применение только при наличии "женского материала". Между тем известно, что существует половая, индивидуальная чувствительность к химическим веществам. Параметры полового хроматина весьма лабильны к гормональному фону организма, что затрудняет трактовку их изменений.

2. Контактный способ воздействия исследуемого вещества на тест-объект позволяет использовать способ только для определения чувствительности организма к какому-либо одному веществу в заданной дозе, между тем, в реальных условиях, организм сталкивается, как правило, с "букетом" эколого-профессиональных факторов.

3. Контактность способа обусловливает проведение исследования в сжатые сроки, ввиду нестабильности объекта, в реальных условиях производства это трудно осуществимо. Кроме того, этот прием не позволяет оценить зависимость реакции буккального эпителия от длительности контакта с веществом, что играет ведущую роль при системной реакции организма на воздействующий фактор.

4. Использование при проведении анализа контактного метода воздействия исследуемого вещества на тест-объект не позволяет достоверно экстраполировать полученные данные на организм человека, т.е. в реальных условиях ткани буккального эпителия контактируют не с раствором, а с воздухом, загазованным антропогенными отходами, а следовательно, в организм поступают через эпителий дыхательных путей пары химических соединений.

5. Техника метода не позволяет оценивать исходное функциональное состояние организма, между тем именно от него во многом зависит индивидуальная чувствительность к внешним условиям.

Задачей изобретения является разработка универсального метода определения реакции биологического объекта на фактор среды или их совокупность, позволяющего экстраполировать полученные данные на организм человека с учетом его индивидуальной чувствительности.

Поставленная задача решается тем, что в качестве тест-объекта используются клетки буккального эпителия и морфометрии ядер, по сравнению с контролем, судят о реакции организма на действие физико-химических факторов среды.

Преимуществами способа являются:
1. Возможность его применения при анализе как "женского", так и "мужского" материала.

2. Бесконтактный способ воздействия среды на тест-объект при проведении анализа делает возможным определение его чувствительности к фактору любой природы, с учетом экспозиции и интенсивности, или к сочетанию факторов.

3. Методика подготовки тест-объекта к исследованию обеспечивает его стабильность до 2 ч, что позволяет осуществлять его транспортировку.

4. Инструментальный, количественный способ оценки тест-реакции позволяет провести градации чувствительности к действующему фактору в зависимости от дозы, экспозиции, а также исходного функционального состояния организма. Последнее дает возможность достоверно экстраполировать полученные данные на системный уровень.

Способ осуществляется следующим образом.

Шпателем берут соскоб со слизистой щеки и наносят его тонким слоем на обезжиренное предметное стекло. Препарат фиксируют в течение 20 мин в растворе Карнуа или в метиловом спирте 3 мин. Окрашивают сафранином, обезвоживают и накрывают покровным стеклом. Микроскопируют при увеличении 10х100, измеряют диаметр ядер с помощью окуляр-микрометра.

В случае необходимости транспортировки предметных стекол с буккальным способом на лабораторную базу, они помещаются в чашку Петри и на них пипеткой наносят физиологический раствор комнатной температуры. Подготовленный таким образом препарат можно перевозить или сохранять в течение 2-х ч, функциональная активность клеток эпителия за это время не измеряется. Дальнейшая обработка препарата осуществляется описанным способом.

Окрашенные препараты подвергаются различным неконтактным воздействиям физико-химической природы. Токсичность воздействия оценивают по изменениям диаметра ядер в исследуемых мазках по сравнению с контролем (мазки с физиологическим раствором).

Результаты апробации метода в различных моде- лируемых условиях представлены в примерах.

Пример 1. Цель: изучение длительности сохраняемости препарата. Отобраны 5 здоровых женщин-добровольцев в возрасте 30-40 лет. Утром до завтрака, берут буккальные соскобы, на них наносят физиологический раствор и выдерживают 1 мин при комнатной температуре. Затем фиксируют в метиловом спирте 3 мин, окрашивают сафранином, измеряют диаметры ядер в каждом мазке. От тех же женщин берутся новые соскобы, наносят физиологический раствор, выдерживают 5 мин при комнатной температуре. Фиксируют в метиловом спирте 3 мин, окрашивают сафранином, измеряют диаметр ядер в каждом мазке.

Аналогичным образом проводят исследования буккальных мазков тех же женщин при их инкубации в физиологическом растворе 15 мин, 120 мин, 150 мин. Данные сведены в таблицу 1.

Из приведенных данных видно, что диаметры ядер в течение 2-х часов меняются незначительно. Более, чем 2-х часовая экспозиция вызывает изменение функциональной активности ядер уменьшение диаметра, около 30% /.Т.с. морфометрические данные не претерпевают изменений в течение двух часов и могут быть использованы в качестве критерия нормы при сравнении с изменениями диаметров ядер при аналогичной экспозиции токсического воздействия.

Пример 2. Цель: изучение полового различия морфометрических показателей. Берется несколько буккальных соскобов, полученных аналогичным образом, описанным в примере 1, от здоровых добровольцев мужчин и женщин одного возраста. По указанной выше схеме проводят опыты с инкубацией препарата в физиологическом растворе 1,5, 15, 120, 150 мин при комнатной температуре. Измеряют диаметры ядер в каждом мазке. Данные сведены в табл.2.

Видно, что диаметры ядер клеток эпителия женщин не отличается значительно от таковых в мужских соскобах и изменяются пропорционально экспозиции инкубации в физиологическом растворе. Т.о. избранный показатель является универсальным и не имеет половой зависимости.

Пример 3. Цель: изучение зависимости изменений морфометрических показателей от исходного функционального состояния организма.

Берется несколько буккальных мазков, полученных по методике, описанной выше, у мужчин после приема алкоголя, больных желудочно-кишечным заболеванием, у женщин после респираторного заболевания. По указанной ранее схеме проводят опыт с инкубацией препарата в физиологическом растворе. Измеряют, с помощью окуляр-микрометра, диаметры ядер, данные, полученные от испытуемых, находящихся в сниженном функциональном состоянии, представлены в табл.3. Обращает на себя внимание, что диаметры ядер у этого контингента обследуемых на 15-20% ниже, чем при измерении таковых у здоровых испытуемых. Изменения функционального состояния клеток в динамике развивается более быстрыми темпами. Особенно это было заметно после 15-ти минутной экспозиции, к 150 мин у мужчин диаметр уменьшается на 44% а у женщин на 47%
Можно сделать вывод, что используемый методический прием морфометрического анализа позволяет оценивать исходное функциональное состояние обследуемых.

Пример 4. Цель: изучение изменения морфометрических показателей при действии физических факторов.

Берется несколько буккальных мазков, полученных, как описано в предыдущих примерах, у здоровых мужчин и женщин, а также на фоне сниженного функционального состояния, вследствие перенесенных респираторных заболеваний. По указанной ранее схеме осуществляют опыт с инкубацией препарата в физиологическом растворе 1, 5, 15, 120, 150 мин контрольная группа. 1-я опытная серия мазков (без инкубации в физиологическом растворе) после фиксации подвергается воздействию УФ-облучения интенсивностью 100 лк, с экспозицией 1, 5, 15, 120, 150 мин. 2-я опытная серия подвергается воздействию УФ-облучения с интенсивностью 200 лк с той же экспозицией. Данные представлены в табл. 4, 5. Обращает внимание, что изменения морфометрических параметров под воздействием УФ-облучения имеют фазный характер у испытуемых с нормальным функциональным состоянием. У обследуемых со сниженными адаптационными возможностями (после болезни) изменения диаметра ядер имеют однонаправленный характер постепенное снижение, минимальные значения ниже, чем в контрольной группе. Воздействие УФ с интенсивностью 200 лк индуцирует гиперстрессорную реакцию, без характерной фазы активации (возрастание диаметра), функциональное состояние клеток ухудшается более прогрессивно (табл. 5). На фоне сниженного адаптационного фона этот процесс развивается особенно быстро.

Пример 5. Цель: изучение изменения морфометрических показателей при воздействии химических факторов. Берется несколько буккальных мазков, полученных, как описано выше, у здоровых обследуемых, а также после перенесенной болезни. Проводят опыт с инкубацией препарата в физиологическом растворе 1-150 мин (контрольная группа). 1-я опытная серия (без физ. р-ра) подвергнута воздействию паров эфира с экспозицией 1, 5, 15, 120, 150 мин, 2-я серия подвергнута воздействию паров ксилола аналогичной концентрацией с той же экспозицией. Данные представлены в таблицах 6, 7. Видно, что действие ксилола оказывает более токсичный эффект по сравнению с эфиром. Чувствительность обследуемых на фоне болезни к воздействующему фактору более высокая. Химический фактор является более токсичным для тест-объекта. Эти данные можно экстраполировать на уровень организма, так как отмечено, что на фоне снижения адаптационных возможностей реакция тест-объекта идет более интенсивно. Кроме того, при влиянии химического фактора биосубстрат (соскоб), взятый у женщин, демонстрирует более высокую чувствительность, чем соскоб буккального эпителия мужчин. Это отражает данные И.В.Саноцкого и др.("Методы определения и опасности химических веществ", 1980.) о более высокой чувствительности женского организма к химическим факторам нейротропного действия.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет осуществлять анализ индивидуальной чувствительности организма к конкретной производственно-экологической обстановке, если снижение диаметра ядер к 150-ой минуте наблюдения превышает 45% это указывает на сниженное функциональное состояние организма в результате токсичности факторов среды и недопустимость пребывания работающего в данных условиях.

Использование: в области медицины, в частности токсикологии. Сущность изобретения: в качестве тест-объекта используют клетки буккального эпителия. После воздействия на них исследуемого фактора осуществляют измерение диаметра ядер клеток эпителия и по его уменьшению более, чем на 45%, по сравнению с контролем, судят о токсичности физико-химического воздействия для конкретного индивидуума. Способ позволяет осуществлять анализ чувствительности организма к производственно-экологическим условиям, полученные результаты являются объективным основанием для отбора поступающих на работу. 7 табл.

Способ определения токсичности физико-химических воздействий на организм, включающий воздействие исследуемого фактора или их сочетаний, на клетки буккального эпителия обследуемого, отличающийся тем, что после воздействия осуществляют измерение диаметра ядер клеток эпителия и по его уменьшению более, чем на 45% по сравнению с контролем, судят о токсичности физико-химического воздействия для конкретного индивидуума.