СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ L-ГОМОСЕРИНА Российский патент 1997 года по МПК C12Q1/34 C12Q1/48 

Изобретение относится к области биохимии и может найти применение в биотехнологии, пищевой промышленности, медицине, ветеринарии и в сельском хозяйстве.

Известен способ колориметрического определения L-аминокислот, основанный на их реакции с нингидрином с образованием окрашенных продуктов (Больш. мед. энциклопед. М. Сов. энциклопед. 1961, т. 20, с. 1071 1072).

Однако известный способ мало специфичен для того, чтобы определять индивидуальную аминокислоту, содержащуюся в смеси с другими аминокислотами.

Известен способ определения индивидуальных компонентов анализируемой смеси аминокислот, включающий хроматографическое выделение из смеси индивидуального компонента и его определение в зоне локализации на хроматограмме (Acta Chem. Scand. 1965, v. 19, N 4, p. 1008-1009).

Однако известный способ позволяет определить интересующую исследователя аминокислоту только после хроматографического разделения смеси на индивидуальные компоненты. Для этого необходим тщательный подбор таких условий хроматографического разделения, которые обеспечивают локализацию в зоне на хроматограмме той аминокислоты, определение которой ведется в данный момент. Это требует больших трудозатрат. Отсутствие же четкости в хроматографической картине приводит затем к ошибкам при анализе аминокислот в отдельных зонах, что снижает достоверность результатов определения. Так, например, аминокислоту L-гомосерин, которая не обнаружена в составе природных белков, но является важным промежуточным продуктом биосинтеза ряда незаменимых L-аминокислот, хроматографически крайне трудно отделить от близкого ей по структуре L-треонина. Следствием некачественной картины хроматографического разделения этих аминокислот является их "соопределение", что приводит к завышенным, а значит к недостоверным результатам определения.

Техническим результатом, достигаемым при реализации настоящего изобретения, является рекомендация условий, обеспечивающих специфическое определение заведомо индивидуальной L-аминокислоты, находящейся в смеси с другими L-аминокислотами, что имеет место в природных материалах: в биологических жидкостях, в гидролизатах белков и т.п. упрощение определения и повышение его достоверности.

Достигается это тем, что в способе определения индивидуальных компонентов анализируемой смеси L-аминокислот, включающем выделение из смеси индивидуального определяемого компонента его идентификацию или количественное определение, отличительной особенностью является то, что в анализируемую смесь вводят маркерное вещество, способное взаимодействовать с компонентами смеси, и фермент, катализирующий реакцию взаимодействия этого вещества только с определяемым компонентом, а после инкубации полученной смеси индивидуальный определяемый компонент выделяют из смеси в виде продукта его взаимодействия с маркерным веществом. В качестве маркерного вещества можно использовать аденозинтрифосфат меченый ³³P в γ-положении, а в качестве фермента - соответствующую определяемой L-аминокислоте киназу. Продукт взаимодействия определяемой L-аминокислоты с аденозинтрифосфатом можно выделить хроматографически, идентифицировать радиоавтографически и количественно определить радиометрически.

В основу способа согласно изобретению положена специфичность реакции взаимодействия именно определяемой L-аминокислоты с маркерным веществом за счет использования строго специфичного катализатора реакции cоответствующего фермента. Это позволяет получать заведомый продукт ферментативной реакции и извлечь из смеси аминокислот заведомо только определяемую аминокислоту в виде продукта ее взаимодействия с маркерным веществом.

Способ, согласно изобретению, позволяет поочередно извлекать из анализируемой смеси L-аминокислот только одну из них в виде ее производного и затем определять ее любыми доступными приемами. В отличие от известного способа, в котором определение индивидуального компонента смеси проводится только по его положению на хроматограмме, новый способ предусматривает предварительное получение продукта взаимодействия только определяемой L-аминокислоты с маркерным веществом и лишь последующее хроматографическое разделение. Такая последовательность операций обеспечивает достоверность определения выделенного из смеси производного L-аминокислоты, поскольку она имеет маркер, обеспечивающий дифференциацию соединений в случае их локализации в одной и той же зоне на хроматограмме. Соответственно отпадает необходимость в тщательном подборе условий хроматографического разделения компонентовсмеси, что упрощает способ, снижает его трудоемкость.

Маркерными веществами помимо ³³P g-АТФ могут быть другие вещества, способные взаимодействовать с аминокислотами в ферментативных реакциях, например: ацетил-коэнзим А, глутаминовая и аспарагирновая кислоты и т.д.

Соответственно при этом используют ферменты: ацетилтрансферазы и трансаминазы.

Настоящее изобретение иллюстрирует лишь пример определения аминокислоты L-гомосерина в биологической жидкости, содержащей смесь природных аминокислот.

Пример. Депротеинизированный экстракт печени мыши инкубировали в течение 60 мин при 37^oC, в присутствии 250 мM трис-HCl, рН 7,8; 500 мM KCl; 10 мM MgSO и 10 мM ³³P g-АТФ. После окончания реакции к смеси добавляли в качестве свидетеля заведомый образец немеченого гомосерин-фосфата до концентрации 1 мM. Затем смесь разделяли двумерной восходящей хроматографией на бумаге, в качестве растворителя в первом направлении использовалась смесь: бутанол-уксусная кислота-вода в соотношении 4:1,5:1,5, во втором направлении: н-бутанол-уксусная кислота-пиридин-вода в соотношении 30: 6:20:24. После радиоавтографии полученной хроматограммы ее обрабатывали нингидрином. В результате на хроматограмме был обнаружен только один продукт гомосерин-киназной реакции, меченый ³³P и совпадающий по подвижности с гомосерин-фосфатом, введенным как заведомый образец.

Таким образом, использование гомосеринкиназной реакции позволяет специфически метить изотопом фосфора гомосерин, содержащийся в смеси с другими метаболитами, в том числе L-аминокислотами, и идентифицировать его после хроматографического разделения смеси.

Для количественного определения гомосерина была построена калибровочная кривая зависимости эффективности включения ³³P в гомосеринфосфат от концентрации гомосерина в гомосеринкиназной реакции. Для этой цели достаточно было одномерного хроматографического разделения продуктов реакции с использованием смеси: н-бутанол-уксусная кислота-вода в соотношении 4:1,5:1,5. Было показано, что при определенных концентрациях АТФ и гомосерина можно добиться линейной зависимости включения метки от концентрации гомосерина. Таким образом, используя калибровочный график, можно по содержанию метки в пятне, соответствующем гомосерин-фосфату, определить количество гомосерина в смеси.

Чувствительность метода высокая им можно определить 0,05 пмоль гомосерина.

Таким образом, используя маркерное вещество и фермент, специфически катализирующий взаимодействие такого вещества только с определяемой L-аминокислотой, содержащейся в анализируемой смеси метаболитов, можно выделить определяемую аминокислоту из смеси, идентифицировать ее и количественно определить.

Использование: в биохимии, биотехнологии, пищевой промышленности, медицине, ветеринарии, сельском хозяйстве. Сущность изобретения: для определения L-гомосерина анализируемую смесь аминокислот инкубируют в присутствии L-гомосеринкиназы и ³³P - АТФ. Затем продукт взаимодействия ³³PL-гомосерин выделяют путем хроматографии на бумаге и определяют его радиоавтографически.

1 Способ определения L-гомосерина, включающий хроматографическое разделение анализируемой смеси аминокислот, идентификацию и количественное определение L-гомосерина, отличающийся тем, что перед хроматографическим разделением к анализируемой смеси добавляют L-гомосеринкиназу и <M^>3<D><M^>3<D>Р-АТФ, проводят инкубацию, а после хроматографического разделения полученный <M^ >3<D><M^>3<D>рL- гомосерин определяют путем радиоавтографии.