ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЧЕСКИЙ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ 5-ФТОРУРАЦИЛА Российский патент 1998 года по МПК G01N27/48 

Изобретение относится к области аналитической химии, в частности к вольтамперометрическому способу определения химико-терапевтического средства, применяемого при онкологических заболеваниях - 5-фторурацила (5-фтор-2,4-(1H, 3H)-пиримидиндиона натриевая соль) FY. Количественное определение FY является перспективным и актуальным направлением в оценке эффективности лечения злокачественных заболеваний, позволяет осуществлять контроль за лекарственными препаратами при длительной химиотерапии в пред- и послеоперационных периодах при различных путях введения цитостатика в организм. В связи с этим аналитическая практика предъявляет повышенные требования к совершенствованию методов определения лекарственных препаратов.

В настоящее время имеется сравнительно небольшое число работ по определению урацила и его производных [1-4].

Идентификация FY химическими методами с помощью реактивов осаждения приведена в работе [1]. Такие методы просты, не требуют применения специальной аппаратуры и зачастую используются лишь для качественного обнаружения. Известен способ потенциометрического кислотно-основного титрования FY и других производных урацила в неводных и смешанных средах [2]. Чувствительность определения невелика 10^-1-10^-2 моль/л. Относительная ошибка определения не превышала ± 3%.

Возможность осциллополярографического метода определения серосодержащих урацилов показана в работе [3]. Определение проводили по токам восстановления медного или ртутного комплекса урацилов на фоне 1М KOH с использованием ртутного капельного электрода и электрода "висящая капля" в диапазоне определяемых концентраций 1•10^-5-1•10^-3 моль/л. Относительное стандартное отклонение Sr= 0,03 для концентрации 1•10^-4 моль/л.

Исследовано электрохимическое поведение урацила и его пятнадцати производных методами классической и дифференциально импульсной полярографии на фонах ацетатных, фосфатных и боратных буферных растворах [4-5]. На этих фонах на полярограммах регистрировали катодные волны или пики, соответствующие восстановлению электроактивных групп (например, NO₂, C=O, -C ≡ C-, -C = N-, C-Г и др.). При использовании полярографии для большинства соединений наблюдалась линейная зависимость высоты волны от концентрации в диапазоне определяемых содержаний 10^-5 - 10^-4 моль/л [4]. Определение урациловых производных с дифференциально импульсным или амперометрическим детектированием позволило повысить чувствительность определения до 10^-7 - 10^-6 моль/л (Sr = 0,05-0,29) [5].

Наиболее близким является метод дифференциальной импульсной катодной вольтамперометрии в проточно-инжекционной системе с использованием висящего ртутного капельного электрода (р.к.э.) в боратном буфере pH 7,6-9,3, содержащем 0,001% тритона Х-100 [5]. Наклон градуировочных графиков, для производных урацила, и протяженность линейного участка зависит от природы и положения электроактивного заместителя. Для большинства веществ диапазон определяемых содержаний составляет (1-20)•10^-7 моль/л, для 5-FY-(l-15)•10^-7 моль/л и только для трех производных урацила (хлор-, бром- и иодурацила) минимально определяемая концентрация может быть ниже 1•10^-7 моль/л. Скорость развертки потенциала 5 мВ/с, время осаждения в проточно-инжекционной системе 902 с. Потенциал осаждения для 5-FY равен - 0,215 В (относительно хлорсеребряного электрода). Минимально определяемая концентрация 1•10^-7 моль/л (Sr = 0,06) [5].

В данных условиях определение FY на уровне 10^-9 - 10^-8 моль/л невозможно. Поэтому разработка экспрессных и высокочувствительных методов определения противоопухолевого препарата FY продолжает представлять интерес.

Задачей заявляемого способа является повышение чувствительности и экспрессности определения FY методом дифференциальной вольтамперометрии.

Поставленная задача достигается тем, что FY электрохимически окисляется на стеклоуглеродном (СУ) или пирографитовом (ПГ) электроде на фоне 0,2М гидроксида натрия в 5-10% пропиленкарбонате, или на фоне 0,05М калия фталево-кислого кислого в 10-40% этаноле, регистрацию анодных пиков ведут в режиме дробного дифференцирования при скорости развертки потенциала 10-20 мВ/с и концентрацию 5-фторурацила определяют по высоте анодного пика в интервале потенциалов 0,82-1,07. В относительно насыщенного каломельного электрода.

В прототипе описано использование в качестве фона боратного буфера (смесь 1:1 0,05М Na₂B₄O₇ и 0,01М KNO₃, pH 7,6-9,3 в присутствии тритона Х-100. Определение FY в этих условиях невозможно из-за низкой чувствительности определения и плохой воспроизводимости пиков окисления определяемых веществ, связанных с искажением формы аналитического сигнала, что делает невозможным проведение анализа особенно биологических систем на этих фонах. Предлагаемые в заявляемом способе фоны 0,2М NaOH в 5-10% C₄H₆O₃, 0,05М KC₈H₅O₄ в (10-40%) C₂H₅OH позволяют определять лекарственный препарат на уровне 7•10^-9 - 1•10^-8 моль/л с хорошей воспроизводимостью. Относительное стандартное отклонение не превышает 0,05. Фоны подобраны экспериментально. Абсолютной новизной является экспериментально подобранный фон 0,05 М KC₈H₅O₄ в (5-10)% C₄H₆)₃ и установленных состав смешанных растворителей, от чего зависит количественное определение лекарственных веществ. Использование водноорганических сред позволяет облегчить протекание процесса и, следовательно, снизить минимально определяемую концентрацию вещества, а также способствует хорошей растворимости биоматриц при анализе природных и биологических объектов. Оптимальный диапазон ПК в H₂O (5-10)%, a C₂H₅OH (20-40)% определяется хорошей воспроизводимостью, высокой чувствительностью и фиксированием одного четкого пика окисления определяемого вещества. Более низкие значения ПК (< 5%), этанола (< 20%) и более высокие (> 10%) ПК и (> 40%) этанола нежелательны, так как снижается чувствительность определения, связанная с уменьшением тока окисления определяемого вещества (особенно в смеси ПК-H₂O). По-видимому, это обусловлено изменением вязкости среды, влияющей на скорость подвода вещества к электроду, а следовательно, и на коэффициент диффузии. Кроме того, при больших массовых содержаниях органических растворителей возможна их специфическая адсорбция на поверхности СУ электрода. Это изменяет структуру двойного электрического слоя. Не исключено также влияние растворителя на процесс десорбции продуктов окисления с поверхности электрода. Количественное определение FY впервые стало возможным на указанных фонах на уровне ≤10^-8 моль/л (таблица).

Другим отличительным признаком является использование в качестве индикаторных углеродных электродов: графитового (Г), пропитанного полиэтиленом с парафином в вакууме или эпоксидной смолой, пирографитового (ПГ) и стеклоуглеродного (СУ). В прототипе применяли висящий ртутно-капельный электрод. Электроды из графита обладают самым большим диапазоном анодной поляризации и широкой областью pH как в водных, так и в неводных средах. Они химически устойчивы и доступны для исследователей. Величина потенциалов окисления лекарственных препаратов (в прототипе использованы волны и пики восстановления) на графитовых электродах определяется их строением, структурой, степенью адсорбируемости на гексагонах, имеющих π -зонную структуру, а также возможностей взаимодействия адсорбата с адсорбентом. По легкости окисления определяемых органических веществ электроды можно расположить в ряд: Г<СУ≤ПГ, (потенциалы пика FY соответственно равны: 0,80-1,0 В; 0,85-1,03 В; 0,87-1,1 В. По-видимому, адсорбция плоскостью молекул органического соединения и структурное подобие материала электрода благоприятствует переходу электронов при меньшем значении потенциала и способствует более легкому и обратимому окислению вещества на графите, чем на СУ- и ПГ-электродах. Наибольшая величина тока достигалась на электроде из графита (больше на 25%), что обусловлено, видимо, более упорядоченной структурой графита по сравнению с искусственными графитами, и особенно пирографитом (объем пор у графита составляет 2-3%, у пирографита - до 85%).

Несмотря на более высокую чувствительность и легкость окисления FY на графитовом электроде он оказался менее удобным в работе из-за высокого значения остаточного тока и плохой воспроизводимости аналитического сигнала, чем СУ-электрод, особенно при количественном определении FY в биологических средах (лимфе и плазме крови).

Для определения лекарственных препаратов впервые использовали "игольчатые" по форме СУ индикаторные электроды. Отличие их от торцовых электродов обусловлено влиянием формы электрода на протекание электрохимического процесса. При использовании "игольчатого" индикаторного электрода диффузия вещества протекает по-разному к цилиндрической и сферической частям его поверхности. Поэтому в выражение для тока добавляется дополнительное стационарное слагаемое [6]. В связи с этим использование "игольчатых" электродов в аналитической практике позволило увеличить чувствительность определения FY. Ртутно-пленочные "игольчатые" электроды использовались ранее для определения металлов и некоторых органических веществ. Графитовые (СУ, ПГ) "игольчатые" электроды впервые использованы для определения противоопухолевых препаратов.

Важным фактором при определении лекарственных веществ является выбор скорости изменения потенциала. Оптимальной является скорость 10-20 мВ/с. Увеличение скорости более 20 мВ/с при линейно меняющемся потенциале увеличивает чувствительность, но при этом растет остаточный ток и искажается форма поляризационных кривых, что затрудняет съемку вольтамперограмм. Использование скоростей менее 10 мВ/с существенно снижает величину анодного тока, понижает чувствительность определения лекарственных веществ и снижает экспрессность анализа.

Использование дробного дифференциального режима записи вольтамперограмм позволяет фиксировать четкие узкие пики, что повышает разрешающую способность способа, позволяет одновременно из одной пробы (при необходимости) селективно определять FY и другие лекарственные вещества, например адриабластин, а также облегчает автоматизацию электродного процесса.

Таким образом, предлагаемый вольтамперометрический способ на основе реакция электроокисления (в прототипе использован для количественного определения FY процесс восстановления), на СУ-электроде является перспективным направлением, способным решать проблемы количественного определения противоопухолевых лекарственных средств в водных и биологических системах, приводящие к улучшению метрологических характеристик анализа.

Установленные условия впервые позволили количественно определять FY на уровне 7•10^-9 моль/л в присутствии пигментов и белковых веществ, в мутных и окрашенных средах без предварительного выделения их из многокомпонентных систем.

Пример 1. Определение 5-фторурацила на уровне 10^-8-10^-7 моль/л в плазме или сыворотке крови^*.

В кварцевый стаканчик емкостью 15-20 мл наливают 5 мл 0,2М NaOH в 10% пропиленкарбонате. Раствор деаэрируют азотом с содержанием кислорода менее 0,001% в течение 5 мин. Отключают газ и снимают анодную дифференциальную вольтамперограмму при скорости развертки потенциала 15 мВ/с, начиная с потенциала 0,5-0,6 В. Отсутствие пиков свидетельствует о чистоте фона. Затем добавляют 1-2 мл пробы, очень осторожно перемешивают раствор 10 с, отключают газ и вновь фиксируют вольтамперограмму. Пик для указанной концентрации лекарственного вещества регистрируют в диапазоне потенциалов от 0,82 до 0,95 В при чувствительности прибора (1-2)•10^-9 А/мм. Затем добавляют несколько капель объемом 0,01 мл стандартного раствора FY (1-2)•(10^-5-10^-4) моль/л, перемешивают раствор 10 с и записывают вольтамперограмму в тех же условиях. Содержание FY в плазме оценивают методом добавок аттестованных смесей с учетом разбавления пробы по общепринятой методике. Время анализа одной пробы не превышает 10-15 мин.

^* Для анализа использовалась кровь у 34 больных, страдающих распространенным раком желудка. Проведено изучение фармакокинетики FY при внутриаортальном, внутривенном, эндолимфатическом введении и дачи внутрь 1000 мг препарата. Концентрация цитостатика определялась до введения, в момент введения, через 2, 6, 12 и 24 ч.

Для определения более высоких содержании 10^-6-10^-5 моль/л можно также использовать фоны, приведенные в таблице.

Таким образом, предлагаемый способ позволил существенно улучшить метрологические характеристики анализа FY. Нижняя граница определяемых содержаний равна 7•10^-9 моль/л. По сравнению с прототипом чувствительность определения повышается примерно на 1,5 порядка, время анализа может быть сокращено более чем в два раза.

Предложенный способ прост, эксспресен, не требует применения большого количества реактивов, обладает хорошей воспроизводимостью и абсолютной чувствительностью (для анализа достаточно 0,5-1 мл плазмы, лимфы или сыворотки крови). Способ высокоселективен: не мешают определению 2,6,8-триоксипурин (мочевая кислота), содержащаяся в крови, аскорбиновая кислота, наркотические средства (фентанин, дитилин, промезол, тиопентан натрия, дропередол и др.), аминокислоты, белки, витамины группы В. Использование предлагаемого способа позволило впервые разработать экспрессную методику количественного определения нанограммовых концентраций антрациклиновых противоопухолевых средств на примере FY в сложных по составу биосистемах без предварительного отделения от основы которая в настоящее время апробирована в ряде онкологических диспансеров и НИИ г. Томска и г. Барнаула.

Данный способ может применяться для фармакокинетических исследований антибиотиков (например, фторофура и др.) в межклеточных жидкостях, слюне, костях, крови, а также для оценки качества и идентификации лекарственных форм в фармацевтических препаратах и технологических средах, а также в воздухе рабочей, зоны промышленных предприятий.

Источники информации
1. Владимирская Е.В., Мквова Д.А., Демчук О.Г. Реакции осаждения некоторых противоопухолевых средств. Фармация. 1990, N 2, с. 77.

2. Веверис А.Я. Исследование кислотно-основных свойств производных пиримидина и пурина в неводных растворах и их количественное определение методами потенциометрического титрования. Автореферат дис. на соиск. учн. ст. к.х. н. М., 1978. 23 с.

3. Архангельская Е.Д., Гороховская В.И., Лаптева Л.П. Вольтамперная осциллополярография урацила (2,4-диоксипиримидина) и его тиопроизводных. Ж. аналит. химии, 1977, т. 32, N 8. с. 1624-1627.

4. Bouzid B., Macdonald A.M.G. Polarographic study of uracil derivatives. Anal. chim. 1988, v. 211, N 1-2, c. 155-173.

5. Bouzid B., Macdonald A.M.G. Hon-injection methodos for the detemination of uracil derivatives with voltammetric detection. Anal. chim. acta. 1988, v. 211, N 1-2, c. 175-193.

6. Назаров Б.Ф. Теоретические основы амальгамной полярографии с накоплением. Томск: ТПИ, 1976, 50 с.

Изобретение относится к области аналитической химии, в частности к вольтамперметрическому способу определения химико-терапевтического средства, применяемого при онкологических заболеваниях - 5-фторурацила. Сущность изобретения: 5-фторурацил электрохимически окисляется на стеклоуглеродном или пирографитовом электроде на фоне 0,2 М гидроксида натрия в 5 - 10%-ном пропиленкарбонате, или на фоне 0,05 М калия фталевокислого кислого в 10 - 40%-ным этаноле, регистрацию анодных пиков ведут в режиме дробного дифференцирования при скорости развертки потенциала 10 - 20 мВ/с и концентрацию 5-фторурацила определяют по высоте анодного пика в интервале потенциалов 0,82 - 1,07 В относительно насыщенного каломельного электрода. 1 табл.

Вольтамперометрический способ определения 5-фторурацила, включающий электрохимическую обработку на электроде в буферном растворе, отличающийся тем, что ведут электрохимическое окисление вещества на стеклоуглеродом или пирографитовом электроде на фоне 0,2 М гидроксида натрия в 5 - 10%-ном пропиленкарбонате, или на фоне 0,05 М калия фталевокислого кислого в 10 - 40%-ном этаноле, регистрацию анодных пиков ведут в режиме дробного дифференцирования при скорости развертки потенциала 10 - 20 мВ/с и концентрацию 5-фторурацила определяют по высоте анодного пика в интервале потенциалов 0,82 - 1,07 В относительно насыщенного каломельного электрода.