ИНВЕРСИОННО-ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЧЕСКИЙ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ВИТАМИНА B*001 Российский патент 1997 года по МПК G01N27/26 

Изобретение относится к области аналитической химии, в частности к инверсионному вольтамперометрическому способу определения витамина B₁ (тиамин; 4-метил-5- β -оксиэтил-N-/2-метил-4-амино-5-метилопиримидил/-тиазолий бромида /или хлорида/ гидробромид /или гидрохлорид/), катализирующего некоторые стадии метаболизма сахаров в организме человека и животных, входя в состав ферментов, участвующих в углеводном обмене, в окислительном декарбоксилировании a-кетокислот и в транскетолазной реакции. Препараты витамина B₁ применяют как специфические средства для предупреждения и лечения гипо- и авитаминоза, невритов, радикулитов, невралгии, периферического паралича и других заболеваний.

Определение микроколичеств тиамина очень важно для оценки качества сырья и пищевых продуктов, идентификации действующих веществ в лекарственных формах витаминов группы B и в матрицах органической природы (в биосистемах: крови, лимфе, плазме, костях и других объектах). В связи с этим, аналитическая практика предъявляет повышенные требования к совершенствованию методов определения витаминов.

Старейшими методами обнаружения витамина B₁ являются химические методы, основанные на цветных реакциях, характерных для пиримидинового и тиазолового колец, входящих в молекулу [1] Известен способ [2] титриметрического определения витамина B₁ в присутствии гидро- или дигидрофосфата натрия в кислой среде. В качестве титранта использовали раствор вольфрамата натрия. Такие методы просты и доступны, не требуют применения специальной аппаратуры. Однако, чувствительность их невелика 10^-1 - 5,7•10^-3 мг/мл. Многие же задачи химического анализа связаны с определением следов органических веществ, часто находящихся в пробах на уровне миллиардных долей и даже ниже, и поэтому эти методы не нашли широкого применения для количественного определения водорастворимых витаминов и зачастую они используются для качественного обнаружения.

Наиболее распространенными в современных лабораториях и рекомендованными нормативными документами являются флюорометрические методы [3, 4] основанные на окислении тиамина в щелочной среде железосинеродистым калием с образованием сильнофлюоресцирующего в ультрафиолетовом свете соединения тиохрома, интенсивность флюоресценции которого прямопропорциональна содержанию витамина (максимум возбуждения при 365 нм и максимум флюоресценции при 435 нм). Анализ затрудняется наличием в ряде объектов веществ, обладающих флюоресценцией. Маскируя флюоресценцию тиохрома, эти вещества искажают результаты анализа и делают невозможным проведение определения без специальных обработок проб [3] Предел обнаружения витамина 0,5•10^-4 мг/мл. В пищевых продуктах, поливитаминных (ПВ) препаратах, биосистемах витамин B₁ может находиться в свободном состоянии и в виде фосфорных эфиров, связанных с белком-тиаминпирофосфата и не может быть определен этими методами без предварительного длительного (более 2-х суток) выделения с использованием большого числа вспомогательных операций, реактивов и дорогостоящих ферментов [3, 4]
Широкое распространение при определении водорастворимых витаминов получили различные варианты хроматографии [5] Методики анализа методом ТСХ связаны со значительными трудностями при количественной оценке хроматограмм и имеют невысокую разрешающую способность. Метод ГЖХ обладает высокой селективностью, но анализ требует предварительного выделения компонентов из реакционной смеси и получения летучих производных, что крайне затруднительно при использовании водорастворимых витаминов. В основном этот метод используется при исследовании термостабильных веществ. В последнее время наибольшее применение для анализа витамина B₁ за рубежом получил метод ВЭЖХ [6, 7] Для увеличения чувствительности определения используют УФ, флуориметрическое и электрохимическое детектирование. Для разделения витаминов применяют обращенно-фазный, ион-парный и ионнообменные варианты ВЭЖХ, изокритический и градиентный режимы хроматографирования. Несмотря на высокую чувствительность вариантов метода ВЭЖХ (10^-5 10^-6 мг/мл), длительность анализа, а также высокая стоимость приборов, существенно ограничивает его использование.

Электроаналитические методы, и в первую очередь такие его высокочувствительные варианты, как инверсионная вольтамперометрия (ИВА), пережили в последние годы своеобразное "возрождение", и не только по причине невысоких затрат на их реализацию по сравнению с другими методами, но и потому, что они отвечают современным требованиям к контролю качества разнообразных и сложных по составу систем и при соблюдении требований ультрамикроанализа вполне реально определение 10^-8 10_-9 мг/мл. Однако большинство опубликованных работ по анализу электрохимическими методами посвящено определению металлов. Идентификация органических веществ, их метаболитов, лекарственных и ПВ препаратов становится с каждым годом все более серьезной проблемой.

Электрохимическому исследованию витамина B₁ посвящены единичные работы [8, 9] Наиболее близким является полярографический метод [8] (прототип). Определение проводят по высоте волны восстановления витамина при потенциале E_1/2, равном (1,25 1,30) В относительно насыщенного каломельного электрода (нас. к.э.) на фоне 0,1 M KCl (pH 7,0 7,2) с использованием ртутного капельного электрода (р.к.э.). Предел обнаружения не указан. Минимальная определяемая концентрация водорастворимых витаминов этим методом практически равна 10^-3 10^-4 мг/мл. В данных условиях определение витамина B₁ на уровне (10^-8 10^-7) мг/мл невозможно.

Информации о применении метода ИВА для определения витамина B₁ в литературе практически нет. Поэтому разработка экспрессных и высокочувствительных методов определения витамина продолжает представлять интерес.

Задачей заявляемого изобретения является повышение чувствительности определения витамина B₁, экспрессности и селективности методом катодной инверсионной вольтамперометрии (КИВ).

Поставленная задача достигается тем, что витамин B₁ электрохимически концентрируется из раствора на поверхности электрода с последующей регистрацией катодных пиков. Новым в способе является то, что электрохимическое концентрирование ведут на ртутно-пленочном электроде при потенциалах (-0,10) (-0,15) В в течение 120 180 с в растворе, содержащем 0,2 М хлорида калия в присутствии соляной или серной кислоты с pH 2 4, или 0,2 М хлорида аммония в присутствии соляной или серной кислоты с pH 2 4, или в буферном растворе Бриттона-Робинсона с pH 2-5, регистрацию катодных пиков ведут при линейной скорости развертки потенциала 20-30 мВ/с и концентрацию витамина B₁ определяют по высоте катодного пика в диапазоне потенциалов (-0,35) (-0,48) В относительно хлорсеребряного электрода.

В прототипе описано использование в качестве фона 0,1 М KCl (pH 7,0 - 7,2). Определение тиамина в этих условиях затруднено из-за низкой чувствительности определения, связанной, по-видимому, с изменением механизма электродного процесса, обусловленного смещением протолитического равновесия органического вещества в растворе или повышением растворимости накопленного осадка витамина B₁ со ртутью в нейтральных и слабощелочных растворах, что делает невозможным проведение анализа на этих фонах на уровне 10^-7 10^-8 мг/мл. Предлагаемые в заявляемом изобретении фоны (смеси 0,2 М KCl или 0,2 М NH₄Cl с кислотами HCl или H₂SO₄, pH 2 4, растворы Бриттона-Робинсона, pH 2 5) позволяют определять тиамин на уровне нанограммовых содержаний с хорошей воспроизводимостью. Относительное стандартное отклонение (Sr) для концентрации 1,4•10^-8 мг/мл не превышает 0,2. Все фоны подобраны экспериментально. Абсолютной новизной является использование смесей KCl или NH₄Cl с кислотами и установленный pH раствора, от чего зависит количественное определение витамина. Использование смесей солей с кислотами позволяет регистрировать катодные вольтамперограммы в виде одного четкого пика. Кроме того, добавление кислот приводит к лучшей воспроизводимости при анализе биологических и природных объектов, способствует стабилизации и осаждению следов растворимых белков в таких пробах. Оптимальный диапазон pH практически для всех фонов 2 5 определяется хорошей воспроизводимостью и фиксированием одного пика восстановления осадка (концентрата витамина со ртутью). Более низкие значения pH (pH < 2) и более высокие (pH > 5) нежелательны, т.к. увеличивается остаточный ток, а при pH > 5 также возможна регистрация дополнительного предпика при потенциале -(0,2 0,3) В, что снижает чувствительность, экспрессность и селективность определения. Количественное определение витамина B₁ впервые стало возможным на этих фонах на уровне 10^-8 - 10^-7 мг/мл методом КИВ (табл. 1).

Одним из радикальных путей повышения чувствительности определения витамина за счет увеличения фарадеевской составляющей тока является предварительное электрохимическое концентрирование определяемого вещества, подобрав для контроля эффективности такого осаждения потенциал электролиза (в прототипе тиамин определяли без предварительного накопления). Из табл. 2 видно, что областью оптимальных потенциалов накопления является потенциал -(0,1 0,15) В относительно хлорсеребряного электрода. При потенциалах -0,1 < E_э < -0,15 уменьшалась величина тока. При E_э > 0,1 В мог появляться дополнительный невоспроизводимый пик при более положительном значении потенциала, обусловленный восстановлением ионов ртути, которые образуются в растворе за счет увеличения скорости отвода ионов металла в глубину раствора при высокой анодной поляризации электрода. Без предварительного электролиза невозможно количественное определение витамина на уровне 10^-8 10^-7 мг/мл. Электрохимическое концентрирование повышает чувствительность, позволяет экспрессно проводить анализ витамина B₁ без предварительного отделения красящих веществ (пигментов) в мутных средах.

Другим отличительным признаком является использование в качестве индикаторного электрода ртутно-пленочного электрода, представляющего собой пленку ртути толщиной 10 20 мкм, нанесенную на серебряную подложку (в прототипе применяли р. к. э. ). Существенным преимуществом такого электрода является возможность получения более узких и высоких пиков, служащих аналитической характеристикой определяемого вещества, за счет значительного возрастания отношения активной поверхности к объему ртути и уменьшения времени выхода определяемого вещества из тонкой пленки (в два-три раза по сравнению с р.к. э. ) [10] Величина ширины полупика (σ_1/2) характеризующая разрешающую способность метода может быть равной 80/n мВ для обратимых и мВ для необратимых электродных процессов. В случае же образования пассивных пленок, величина σ_1/2 может быть снижена до 10/n мВ и меньше [10] Предел обнаружения большинства элементов и органических веществ, определяемых методом инверсионной вольтамперометрии при использовании таких электродов ниже, чем на ртутных. Пики, полученные с использованием р.п.э. с Ag-подложкой, также характеризуются лучшей воспроизводимостью, кроме того, такие электроды являются менее токсичными, чем р.к.э. и более удобными в практической работе. Для определения витаминов ртутно-пленочный электрод ранее не применялся.

Важным для определения витамина B₁ методом КИВ является выбор скорости развертки потенциала. Оптимальной является скорость 20-30 мВ/с. Увеличение скорости более 20 мВ/с увеличивает чувствительность, но при этом растет остаточный ток и уменьшается разрешающая способность способа. При скорости менее 20 мВ/с снижается величина анодного тока и понижается чувствительность определения витамина. Значение используемой скорости в прототипе не приведено.

Время предварительного электролиза выбирают в зависимости от концентрации определяемого вещества. Максимальное значение величины катодного тока достигается при τ_э, равном 120-180 с. При τ_э < 120 с снижается чувствительность определения, а при τ_э > 180 с снижается экспрессность анализа.

Таким образом, установленные условия впервые позволили количественно определять витамин B₁ на уровне 1,4•10^-8 мг/мл без предварительного отделения от других водорастворимых витаминов. Диапазон определяемых содержаний 10^-8 10^-3 мг/мл. Определению не мешают тысячекратные избытки лимонной, молочной, щавелевой, аскорбиновой, никотиновой, мочевой кислот, мочевины, ряда фенольных и оксисоединений, пиридоксина, образующихся в небольших количествах в живом организме. Стократный избыток галогенид-ионов, PO3-4

ионов тяжелых металлов Zn²⁺, Cd²⁺, Pb²⁺, Cu²⁺, Fe²⁺, Fe³⁺ практически не влияют на количественное определение витамина в установленных оптимальных условиях проведения электродного процесса. Предлагаемый способ позволяет селективно определять витамин B₁ в присутствии рибофлавина (витамина B₂), витаминов B₆, B_C, B₁₂, PP, C.

Пример 1. Определение витамина B₁ на уровне 10^-8 - 10^-7 мг/мл.

В кварцевый стаканчик емкостью 20 мл наливают 10 мл 0,2 М KCl и добавляют 1-2 капли перегнанной HCl до pH 3 4. Раствор деаэрируют азотом с содержанием кислорода менее 0,001% (ос.ч.) в течение 5 мин, не прекращая перемешивания проводят электролиз раствора при условии: E_э 0,15 В; τ_э 180 с. Отключают газ и фиксируют катодную вольтамперограмму при скорости развертки потенциала 20 мВ/с, начиная с потенциала E_нач. 0,20 В. Отсутствие пиков свидетельствует о чистоте фона. Затем добавляют 1 2 капли объемом 0,01 мл стандартного раствора витамина (2-5)•10^-5 мг/мл, перемешивают 10 с и проводят электрохимическое накопление осадка витамина при E_э -0,15 В и τ_э 180 с. Съемку вольтамперограммы начинают с потенциала -0,20 В. Катодный пик для указанной концентрации витамина регистрируют в диапазоне потенциалов от -0,40 до -0,48 В при чувствительности прибора 1•10^-9 А/мм. Время единичного анализа не превышает 15 мин.

Пример 2. Определение витамина B₁ в сыворотке (плазме) крови (использовалась сыворотка (плазма) крови после многократной аппликации лечебными грязями).

В кварцевый полярографический чистый стаканчик емкостью 15 20 мл наливают 5 мл фона буфера Бриттона-Робинсона, pH 5. В течение 5 мин удаляют из раствора кислород газообразным азотом марки ос. ч. Снимают вольтамперограмму фона при линейной развертке потенциала 20 мВ/с при условии: E_э -0,10 В; τ_э 120 с, E_нач. -0,15 В. Затем в стаканчик добавляют 0,04 0,1 мл сыворотки (плазмы) крови, перемешивают 10 с и вновь снимают катодную вольтамперограмму при тех же условиях накопления. Пик витамина регистрируют в диапазоне потенциалов -(0,32 0,40) В при чувствительности прибора (1 - 2)•10^-9 А/мм. Добавляют 1 каплю (объем капли 0,02 0,04 мл) стандартного раствора витамина B₁ (pH 4 5) концентрацией 10^-4 мг/мл, проводят электролиз при E_э -0,10 В, τ_э 120 с и затем регистрируют катодный пик в том же диапазоне потенциалов при чувствительности прибора 2•10^-9 А/мм. Концентрацию витамина оценивают методом добавок стандартного раствора с учетом разбавления пробы. Время единичного анализа не превышает 15 мин.

Пример 3. Определение витамина B₁ в водных вытяжках сапропелий.

5 мл водной вытяжки помещают в электролизер, добавляют 1 каплю (0,024 мл) концентрированной H₂SO₄, перемешивают раствор азотом (марки ос.ч.) в течение 5 мин и проводят электрохимическое накопление при E_э -0,15 В и τ_э 120 с. Отключают газ и снимают вольтамперограмму, начиная с E_нач. -0,25 В при скорости наложения потенциала 30 мВ/с. Пик регистрируют в диапазоне потенциалов -(0,45^oC0,50) В при чувствительности прибора 4•10^-9 1•10^-8 А/мм. Концентрацию витамина определяют методом добавок стандартного раствора. Время анализа одной пробы 15 20 мин.

Для получения хорошо воспроизводимых пиков, особенно при анализе крепких растворов, рекомендуется проводить обновление поверхности р.п.э. путем его поляризации при потенциале -1,5 В, в течение 30 60 с.

Таким образом, катодный инверсионный вольтамперометрический способ с использованием ртутно-пленочного электрода позволил существенно улучшить метрологические характеристики анализа витамина. Предел обнаружения, рассчитанный по 3 σ-критерию равен 8•10^-9 мг/мл. Минимально определяемая концентрация витамина B₁ 1,4•10^-8 мг/мл. По сравнению с прототипом чувствительность определения повышается примерно на 2 - 3 порядка. По сравнению с методами, рекомендованными нормативными документами [3] время анализа витамина B₁ может быть снижено более чем в 100 раз.

Предложенный способ может быть применен для анализа сложных по составу природных систем, биоматериалов, для контроля качества пищевых продуктов, фармацевтических и лекарственных препаратов. Вольтамперограммы хорошо воспроизводимы, условия съемки легко могут быть автоматизированы. Методики отличаются простотой выполнения и могут быть использованы в любой лаборатории, имеющей полярограф, особенно в настоящее время, когда налажен выпуск отечественных приборов многими фирмами.

Литература
1. Кушманова О. Д. Ивченко Г.М. Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии. М. Медицина, 1983. 272 с.

2. Сичко А.И. Скребцов Н.А. Способ количественного определения тиамина бромида. Авт. св. 4746589/00-04 /22/ 891005 G 01 N 31/16.

3. ГОСТ 25999-83. Продукты переработки плодов и овощей. Методы определения витаминов B₁ и B₂. М. Госкомитет по стандартам, 1984. 11 с.

4. Химический состав пищевых продуктов. М. Легкая промышленность, 1984. 320 с.

5. Ульянова С.В. Шавлинский А.М. Морев С.Н. Дмитренко Т.С. Финкельштейн Е.И. Кирсанов А.Г. Использование физико-химических методов в анализе поливитаминных препаратов, содержащих водорастворимые витамины B₁, B₂, B₆, C и никотинамид.//Фармация. 1993. Т. 42, N 3. -с. 60-62.

6. Gilpin R. K. Pachla L.A. Pharmaceuticals and Related Drugs.//Anal. Chem. 1993. Vol. 65 P. 117 R 132 R.

7. Favell Derek. Nutritional analysis Vitamins and minerals.//Food Sci and Technol. 1988. Vol. 2, N 3. P. 199-200.

8. Крюкова Т.А. Синякова С.И. Арефьева Т.Б. Полярографифечский анализ. М. ГНТИ химической литературы, 1959, 772 с.

9. Рейшахрит Л.С. Электрохимические методы анализа. Л. Издательство Ленинградского университета, 1970. -199 с.

10. Назаров Б.Ф. Теоретические основы амальгамной полярографии с накоплением. Томск. ТПИ, 1976. 50 с.

Изобретение относится к области аналитической химии, в частности к инверсионному вольтамперометрическому способу определения витамина B₁, участвующего в каталитических реакциях в живом организме. Витамин B₁ электрохимически концентрируется на поверхности электрода с последующей регистрацией катодных пиков, отличающийся тем, что электрохимическое концентрирование ведут на ртутно-пленочном электроде при потенциалах (- 10) - (- 0,15) В в течение 120-180 с в растворе, содержащем 0,2 М хлорида калия в присутствии соляной или серной кислоты с pH 2-4, или 0,2 М хлорида аммония в присутствии соляной или серной кислоты с pH 2-4, или буферном растворе Бриттона-Робинсона с pH 2 - 5, регистрацию катодных пиков ведут при линейной скорости развертки потенциала 20-30 мВ/с и концентрацию витамина B₁ определяют по высоте катодного пика в диапазоне потенциалов (-0,35)-(-0,48) В относительно хлорсеребряного электрода. 2 табл.

Инверсионно-вольтамперометрический способ определения концентрации витамина B₁, включающий электрохимическое концентрирование витамина B₁ из раствора на поверхности электрода с последующей регистрацией катодных пиков, отличающийся тем, что электрохимическое концентрирование ведут на ртутно-пленочном электроде при потенциалах (-0,10) (-0,15) В в течение 120 180 с, в растворе, содержащем 0,2 моль хлорида калия в присутствии соляной или серной кислоты с pH 2 4, или 0,2 моль хлорида аммония в присутствии соляной или серной кислоты с pH 2 4, или в буферном растворе Бриттона Робинсона с pH 2 5, регистрацию катодных пиков ведут при линейной скорости развертки потенциала 20 30 мВ/с и концентрацию витамина B₁ определяют по высоте катодного пика в диапазоне потенциалов (-0,35) (-0,48) В относительно хлорсеребряного электрода.