СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ИЗ БАКТЕРИЙ Российский патент 1997 года по МПК C12P19/34 C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии, а именно к способам получения нуклеиновых кислот и может быть использовано в пищевой, химической и медицинской промышленностях.

Известен способ извлечения нуклеиновых кислот из водородокислящих бактерий типа Alcaligenes eutrophus Z-1, заключающийся в том, что суспензию клеток бактерий Alcaligenes eutrophus Z-1 обрабатывают смесью бензилового или изобутилового спирта (20-30:5-30% по объему), или бензилового спирта и хлороформа (30-40: 10-20% по объему), перемешивают, оставляют при комнатной температуре на 40 мин 4 ч, затем разбавляют в 3-10 раз 5% раствором NaCl и 0,4% Na-цитратом, центрифугируют и нуклеиновые кислоты из супернатанта осаждают этанолом [1]
Данный способ отличается простотой, но не обеспечивает комплексного использования сырья, так как бактерии после обработки в значительной степени загрязнены органическими веществами, что делает невозможным их дальнейшее использование. Вторым недостатком данного способа является то, что конечным продуктом является смесь нуклеиновых кислот, для разделения которых необходимы дополнительные затраты.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа получения нуклеиновых кислот без применения органических веществ из бактериальной биомассы, позволяющего получить чистую рибонуклеиновую кислоту (РНК) и смесь дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и РНК.

Поставленная задача решается тем, что в способе получения нуклеиновых кислот из бактерий в качестве бактерий используют биомассу нативных клеток метанутилизирующих бактерий Methylococcus capsulatus, и процесс экстракции нуклеиновых кислот проводят водно-щелочным или водно-солевым растворами последовательно, на первой стадии отделяют РНК при pH не выше 7,5 и t=85-90^oC, на второй стадии отделяют смесь РНК и ДНК при pH=8,6-9,0 и t=85-90^oC, с разделением ее известными способами.

Для проведения первой стадии готовят водно-щелочную суспензию бактериальной биомассы с содержанием сухих веществ (СВ) 5% и pH7,5 (pH суспензии доводят аммиачной водой) или водно-солевую суспензию аммонийной соли ортофосфорной кислоты с концентрацией фосфата 1,5-1,75 моль/л и pH7,5, суспензию прогревают при t= 85-90^oC в течение 1 ч, отделяют экстракт РНК от биомассы центрифугированием (10 мин, 6000 об/мин). Из полученного экстракта выделяют препарат РНК известными способами с содержанием основного вещества > 80%
На второй стадии отделяют смесь ДНК и РНК из полученной после центрифугирования биомассы, для чего полученный осадок биомассы разводят водно-щелочным или водно-солевым растворами с pH8,6-9,0 и прогревают суспензию при 85-90^oC в течение 2 ч. Денуклеинизированную биомассу отделяют от экстракта центрифугированием (10 мин, 6000 об/мин). Из экстракта известными способами выделяют очищенную смесь ДНК и РНК с содержанием ДНК>50% и РНК>30%
Изобретение иллюстрируется следующими примерами:
Пример 1.

К 2040 г биомассы метанутилизирующих бактерий Methylococcus capsulatus с содержанием СВ 10% и содержанием нуклеиновых кислот 8,7% в пересчете на сухое вещество, в том числе РНК 7,3% и ДНК 1,2% приливают 3000 мл водно-солевого раствора аммонийной соли ортофосфорной кислоты с содержанием фосфата 3,3 моль/л и pH7,5, перемешивают. Полученную суспензию прогревают до 90^oC, выдерживают при этой температуре, умеренно перемешивая, в течение 1 ч. По окончании процесса экстракции суспензию охлаждают до комнатной температуры и удаляют бактериальную биомассу центрифугированием. Получают 3865 мл экстракта с содержанием нуклеиновых кислот 2,5 г/л и 1267 г сгущенной биомассы бактерий. Из полученного экстракта известными способами получают 3,82 г препарата РНК со следующими характеристиками: сод.суммарных НК 80% ДНК - 1,03% белка 4,2% влаги 10%
Выход РНК от суммарного содержания НК в клетках составляет 21%
К 1267 г полученного водно-солевого осадка бактериальной биомассы добавляют 3400 мл раствора аммонийной соли ортофосфорной кислоты с содержанием фосфата 1,75 моль/л и pH 8,6, перемешивают. Полученную водно-солевую суспензию прогревают до 90^oC и выдерживают при этой температуре и умеренном перемешивании в течение 2 ч. После окончания процесса суспензию охлаждают до комнатной температуры и центрифугируют. Получают 3350 мл водно-солевого экстракта с содержанием НК 1,3 г/л. Из полученного экстракта известными способами выделяют 400 мг ДНК-концентрата со следующими характеристиками: сод. суммарных НК 80% ДНК 50% белка 4,5% влаги 10%
Выход ДНК-концентрата от суммарного содержания НК в клетках составляет 1,5%
Пример 2
К 3140 г биомассы метанутилизирующих бактерий Methylococcus capsulatus с содержанием СВ 20% и содержанием нуклеиновых кислот пересчете на сухое вещество 8,5% в том числе РНК 7,2% и ДНК 1,3% приливают 5020 мл дистиллированной воды и перемешивают. Полученную суспензию титруют аммиачной водой до pH 7,5, нагревают до 90^oC, выдерживают при этой температуре и умеренном перемешивании в течение 1 ч. По окончании процесса экстракции суспензию охлаждают до комнатной температуры и удаляют бактериальную биомассу центрифугированием. Получают 4750 мл экстракта с содержанием НК 2,2 г/л и 3400 г сгущенной биомассы бактерий. Из полученного экстракта известными способами получают 3 г очищенного препарата РНК со следующими характеристиками: сод.суммарных НК 80% ДНК 3,5% белка 2,07% влаги 10%
Выход РНК от суммарного содержания НК в клетках составляет 11,5%
К 3400 г полученного осадка бактериальной биомассы с содержанием СВ 20% добавляют 9900 мл дистиллированной воды и перемешивают. Полученную суспензию титруют аммиачной водой до pH 9,0, нагревают до 85^oC и при перемешивании выдерживают данную суспензию 2 ч. После окончания процесса суспензию охлаждают до комнатной температуры и центрифугируют. Получают 9820 мл экстракта с концентрацией НК 1,3 г/л. Из полученного экстракта известными способами выделяют 340 мг ДНК концентрата со следующими характеристиками: содержание суммарных НК 80% ДНК 50% белка 4,8% влаги 10%
Выход ДНК-концентрата от суммарного содержания НК в клетках составляет 1%
Как видно из приведенных примеров, описанный выше способ получения НК из бактерий Methylococcus capsulatus позволяет получить очищенный препарат РНК с содержанием основного вещества более 80% примесью ДНК не выше 5 и белка - не выше 5 и ДНК-концентрат с содержанием ДНК более 50 и примесью РНК не выше 30 белка не выше 5% Данный способ исключает применение органических веществ на стадии экстракции как РНК, так и ДНК, что исключает загрязнение биомассы нежелательными примесями и позволяет использовать ее в дальнейшей переработке.

Использование: биотехнология, микробиология. Сущность изобретения: получение нуклеиновых кислот из биомассы бактерий, для этого используют биомассу бактерий Methylococcus capsulatus, которую подвергают экстракции водно-щелочным или водно-солевым раствором при pH не выше 7,5. На первой стадии отделяют рибонуклеиновую кислоту (температура 85-90^oC), на второй стадии при pH 8,6-9,0 отделяют смесь РНК и ДНК, которые потом разделяют известными способами. Способ позволяет получать препараты ДНК и РНК высокой степени чистоты.

Способ получения нуклеиновых кислот из бактерий, отличающийся тем, что биомассу клеток метанутилизирующих бактерий Methylococcus capsulatus подвергают экстракции водно-щелочным или водно-солевым раствором, причем сначала выделяют РНК при pН 7,0 7,5 и температуре 85 90^oС, а затем при pН 8,6 9,0 и той же температуре выделяют смесь ДНК и РНК с последующим их разделением.