Способ извлечения нуклеиновых кислот из водородокисляющих бактерий ALcaLIGeNeS еUтRорнUS Z-1 Советский патент 1991 года по МПК C12P19/34 C07H21/00 

Изобретение относится к области прикладной биохимии и молекулярной биологии, в частности к способам получения препаратов нуклеиновых кислот.

Цель изобретения - упрощение способа и увеличение выхода целевого продукта.

Разрушение бактериальных клеток, депротеинизация и экстракция конечного продукта осуществляется в одну стадию. Суспензию биомассы 3-16% в расчете на сухой вес в растворе 5-6%-ного NaCI и 0,4-0,5%-ного Na-цитрата перемешивают с системами двух типов: бензиловый и изобу- тиловый спирты (конечная концентрация 20-40 и 5-30 об.% соответственно) или бензиловый спирт и хлороформ (конечная концентрация 20-40 и 10-20 об.%

соответственно) в течение 40-360 мин до образования устойчивой эмульсии, из которой нуклеиновые кислоты экстрагируют раствором 5-6%-ного NaCI и 0,4М Na-цитрата. Дебрис и денатурированные белки удаляют центрифугированием (10 мин, 4000 об/мин) и нуклеиновые кислоты из супернатанта осаждают добавлением этанола (65-70 об.%) при 0-4° С, 4 ч. Все операции проводят при комнатной температуре.

Способ обеспечивает 65-70%-ный выход нуклеиновых кислот из клеток Alcaligenes eutrophus Z-1, получаемые препараты практически свободны от примесей белка.

Пример1.3г биомассы, содержащей 14,7% сухого вещества и 11,2% нуклеинео

Os ISO

VI

вых кислот, перемешивают с 1,2 мл насыщенного раствора NaCI в 2,4%-ном цитрате и с 4,2 мл воды. Получают 6%-ную(по сухому веществу)суспензию в5%-ном NaCI и 0,4%- ном цитрате Na, перемешивают с 2,1 мл бензилового и 1 мл изобутилового спиртов, что соответствует 20 и 10об.%. Выдерживают эмульсию 120 мин, разбавляют в 10 раз 94 мл 5%-ного NaCI и 0.4%-ного цитрата Na, отделяют центрифугированием и отбрасывают осадок. Из раствора осаждают нуклеиновые кислоты двумя объемами этанола при 0° С, собирают осадок центрифугированием, 10 мин 4000 об/мин. Осадок содержит 39,6 мг нуклеиновых кислот, белка осадок не содержит. Выход нуклеиновых кислот 68%.

Пример 2. Зг биомассы, содержащей 12,9% сухого вещества и 10,0% нуклеино- зых кислот в расчете на сухой вес, смешивают с 1 мл насыщенного раствора NaCI в 2,4%-ном цитрате Na. 10%-ную суспензию биомассы смешивают с 2,4 мл бензилового спирта и 1,6 мл хлороформа, что соответствует 30 и 20 об.% соответственно. Эмульсию выдерживают 180 мин при комнатной температуре, разбавляют в 10 раз 72 мл 5%-ного NaCI и 0,4%-ного цитрата Na, отде- ляют центрифугированием при 4000 об/мин 10 мин надосадочную жидкость и осаждают нуклеиновые кислоты двумя объемами этанола при 0° С. Осадок собирают центрифугированием при 0° С, 4000 об /мин. Осадок не содержит белка, содержит 27,1 мг нуклеиновых кислот, что соответствует 70%-ному выходу.

В табл. 1 и 2 приведены результаты получения нуклеиновых кислот.

Предлагаемый способ позволяет добиться более полного выхода нуклеиновых кислот из клеток Alcallgenes etrophus Z-1 (65-70%) по сравнению с результатами выделения по известным способам (до 45%). Важным является и низкое содержание белковых примесей в получаемом препарате нуклеиновых кислот. Способ отличается от известных простотой и непродолжительностью, а также сокращением времени депротеинизации токсическими веществами (хлороформ, фенол). Кроме того, снижается себестоимость конечного продукта за счет использования доступных дешевых реактивов.

Предлагаемый способ может быть использован в крупномасштабном производстве нуклеиновых кислот - важном продукте, являющемся основой для получения ряда ценнейших фармакологических

препаратов. Кроме того, предлагаемый способ может найти применение а практике молекулярнобиологических и биохимических исследований.

Формула изобретения

Способ извлечения нуклеиновых кислот

из водородокисляющих бактерийА1саЙдепе8

eutrophus Z-1, предусматривающий лизис

клеток, отделение раствора нуклеиновых

кислот от клеточного дебриса, его депроте- инизацию и осаждение нуклеиновых кислот спиртом, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и увеличения выхода целевого продукта, лизис клеток с одновременной депротеинизацией проводят путем добавления 3-16% суспензии клеток в 5-6%-ном NaCI и 0,4-0,5%-ном цитрате Na смеси 20-30 об.% бензилового спирта и 5-30 об.% изобутилового спирта или смеси

30-40 об.% бензилового спирта и 10-20 об.% хлороформа, перемешивания, выдерживания при комнатной температуре 40- 240, мин разбавления эмульсии в 3-10 раз смесью растворов 5-6% NaCI и 0,4-0,5%

Na-цитрата и отделения надосадочной жидкости от белков и клеточного дербиса, а осаждение нуклеиновых кислот проводят 65-70% по объему этанолом.

Таблица 1

Изобретение относится к прикладной биохимии и молекулярной биологии, в частности к способам получения нуклеиновых кислот. Целью изобретения является увеличение выхода нуклеиновых кислот, упрощение, ускорение и удешевление процедуры выделения. Отличительной чертой метода является сокращение числа стадий в процессе выделения - разрушение клеток, экстракция и депротеинизация проводятся одновременно. А именно, суспензию клеток бактерий ALCALIGENES EUTROPHUS Z = 1 обрабатывают смесью бензилового и изобутилового (20 - 30: 5 - 30% по объему) или бензилового спирта и хлороформа (30 - 40: 10 - 20% по объему), перемешивают, оставляют при комн. температуре на 40 мин - 4 ч, затем разбавляют в 3 - 10 раз 5%-ным NACL и 0,4%-ным NA-цитратом, центрифугируют и нуклеиновые кислоты из супернатанта осаждают эталоном. Выход препарата составляет 65 - 70%, содержание белков незначительно. Метод может быть использован в крупномасштабном производстве, кроме того, в практике лабораторных работ по биохимии и молекулярной биологии. 1 табл.

Таблица 2