СОЕДИНЕНИЕ НА ОСНОВЕ МАКРОПОРИСТОГО СОПОЛИМЕРА СТИРОЛА И ДИВИНИЛБЕНЗОЛА В КАЧЕСТВЕ ИММУНОСОРБЕНТА ДЛЯ УДАЛЕНИЯ ДИФТЕРИЙНОГО ТОКСИНА ИЗ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ ОРГАНИЗМА Российский патент 1997 года по МПК C12N11/08 A61K39/05 

Изобретение относится к области получения иммуносорбентов и может быть использовано для лечения дифтерии методом иммуносорбции, для проведения различных иммунологических исследований. В настоящее время единственным средством специфического лечения дифтерии является инъекция противодифтерийной сыворотки /1/. В то же время из-за высокой концентрации балластных белков и большой дозы вводимой сыворотки, наличия консерванта в препарате (хлороформа) у больных нередко наблюдаются анафилактический шок, развитие аллергических форм осложнений /2/.

В этой связи наиболее перспективным представляется лечение данного заболевания сорбционными методами, в частности, иммуносорбцией антител дифтерийного токсина. Попытки использовать активированные угли для удаления дифтерийного токсина из плазмы продемонстрировали очень низкий уровень сорбционной емкости по дифтерийному токсину /3/.

Задачей изобретения является разработка иммуносорбента на основе макропористого сополимера стирола и дивинилбензола, обладающего свойством избирательно и эффективно удалять из биологических жидкостей организма антигены дифтерийного токсина.

Поставленная задача решается разработкой нового иммуносорбента - гидрофобно или ковалентно связанной белковой фракции сыворотки крови лошади, гипериммунизированной дифтерийным анатоксином на макропористом сополимере стирола и дивинилбензола общей формулы:

где m=0,087-0,02; n=0,255-0,255; k=0,003-0,012; l=0,655-0,713 с удельной поверхностью 87-102 м²/г, средним эффективным радиусом пор 100-198 нм, имеющего следующий элементный состав и характеристики ( на сухое вещество):
C 30-29%
H 30-28,5%
O 38-39,5%
N 1,84-2,4%
S 0,002-0,006%
Соединение представляет собой светло-коричневые гранулы размером в диаметре 0,05 0,07 см, не растворимые в воде, хлороформе, ацетоне, спирте, в растворах соляной, азотной, уксусной, серной кислот и щелочей.

Способ получения этого соединения в качестве иммуносорбента основан на известной реакции связывания аминогрупп белка с функциональной группой твердофазного носителя /4/, в данном случае с -OH или -CHO, или или P(CH₂OH)(O)OH, предпочтительно с -OH группами.

Такие полимерные носители выпускают на НПО "Биолар" государства Латвия (Т 6-09-10-1494-80, ТУ 6-09-23-16-88, ТУ 6-09-23-17-88, ТУ 6-09-10-1785-86). При иммобилизации сыворотки на носителях на основе макропористого сополимера стирола и дивинилбензола с удельной поверхностью 90-130 м²/г, среднем эффективном радиусе пор 66-100 нм наблюдали фракционирование белков и низкую степень превращения.

Источником антител для приготовления иммуносорбента являлась коммерческая противодифтерийная сыворотка производства НПО "Биомед" г.Уфы.

Способ получения предлагаемого соединения осуществляется обработкой белковой фракцией сыворотки крови лошади, гипериммунизированной дифтерийным анатоксином, макропористого сополимера стирола и дивинилбензола, содержащего в своей структуре функциональную группу, например -OH. Сополимер предварительно выдерживает в фосфатном буфере с pH=7,25-7,35 и иммобилизацию белковой фракции проводят при 22-27^oC в течение 2-4 ч, после чего сорбент промывают пятикратным объемом фосфатного буфера.

Полученный сорбент проявляет свойства иммуносорбента, обладает высокой по сравнению с углями сорбционной емкостью по дифтерийному токсину (ДТ), высокой скоростью извлечения. Емкость иммуносорбента по ДТ составляет 7 DLM/г из плазмы, в отличие от углей, для которых она в этих условиях составляет 0,3-0,6 DLM/г. Увеличение емкости по ДТ на полимерном иммуносорбенте можно объяснить созданием благоприятных условий стерического взаимодействия при образовании иммунного комплекса. Ниже приведены примеры получения и испытания иммуносорбента в эксперименте на животных.

Пример 1. В реактор загружают 20 г макропористого сополимера стирола и дивинилбензола (S_уд= 102 м²/г, r=198 нм, плотность 0,5 см³/г), содержащего в своей структуре 2 мМ/г оксигрупп, предварительно в течение 1 ч набухшего в фосфатном буфере. Вводят 150 мл раствора сыворотки крови лошади, гипериммунизированной дифтерийным анатоксином (с активностью 1700 МЕ/мл), в фосфатном буфере. Реакционную смесь перемешивают и выдерживают при 22^oC в течение 4 ч. По окончании отделяют фильтрованием твердую фазу и промывают последовательно пятикратным объемом фосфатного буфера, избытком 1 М раствора глицина и пятикратным избытком фосфатного буфера. Получают иммуносорбент со степенью превращения по белку 86% Состав сухого вещества следующий: C=30% H= 30% O= 38% N=1,84% S=0,002% При продолжительности процесса больше 4 ч заметного увеличения степени превращения не наблюдали.

Пример 2. В реактор загружают 20 г. макропористого сополимера стирола и дивинилбензола, сыворотку крови лошади, как описано в примере 1. Реакционную смесь перемешивают и выдерживают при 27^oC в течение 4 ч. По окончании процесса проводят обработку твердой фазы, как описано выше. Получают иммуносорбент со степенью превращения по белку 98% Состав сухого вещества следующий: C=29% H=28,5% O=39,5% N=2,4% S=0,006% При увеличении температуры на 5^o или 10^oC степень превращения по белку заметно снижается.

Пример 3. (Испытание иммуносорбента). Навеску сорбента (иммуносорбента и углей для сравнения) порядка 0,5 г или 1 г помещают в бюксы, заливают 2,5 мл плазмы крови человека или фосфатно-солевого буфера (концентрация ДТ в исходной плазме 0,964 DLM/мл, в фосфатно-солевом буфере 0,982 DLM/мл. Чувствительность реакции по контрольному анатоксину составляла 1:16000, по рабочему раствору отстандартизованного дифтерийного токсина также 16000) и проводят инкубацию при 37^oC на встряхивателе в течение 3 ч. Емкость по ДТ для углей была приблизительно одинакова и составляла 0,8-1,3 DLM/г из фосфатно-солевого буфера и 0,3-0,6 DLM/г из плазмы. Емкость иммуносорбента из плазмы составляла 7 DLM/г.

Пример 4. Антигенсодержащий раствор после инкубации (по описанию в примере 1) вводили подкожно в дозе 1,5 DLM морским свинкам. Результаты опыта приведены в табл. 1.

Как видно из табл. 1, животные, получившие вытяжку ДТ, защищенную иммуносорбентом, не погибали в течение 3 мес от начала опыта. В то время как контрольные, без защиты вытяжки сорбентом, погибали на вторые сутки.

В табл. 2 приведены результаты испытаний иммуносорбента в эксперименте на кроликах после введения им внутривенно и внутримышечно ДТ.

Как видно, при внутривенном введении ДТ продолжительность жизни животных после гемосорбции наиболее высока и стабильна после иммуносорбента и при дозе ДТ 2 DLM и при 4 DLM. При внутримышечном введении ДТ результаты эксперимента также в пользу иммуносорбента.

Иммуносорбент для удаления дифтерийного токсина из биологических жидкостей организма на основе макропористого сополимера стирола и дивинилбензола, обладающего свойством избирательно и эффективно удалять из биологических жидкостей организма антигены дифтерийного токсина. 2 табл.

Соединение общей формулы I

где m 0,087 0,02;
n 0,255 0,255;
k 0,003 0,012;
l 0,655 0,713
на основе макропористого сополимера стирола и дивинилбензола с удельной поверхностью 87 102 м²/г, средним эффективным радиусом пор 108 198 нм, плотностью 0,4 0,5 г/см³ в качестве иммуносорбента для удаления дифтерийного токсина из биологических жидкостей организма.