СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КАРДИОЛИПИНОВОГО ИММУНОСОРБЕНТА Российский патент 1997 года по МПК A61K47/00 

Изобретение относится к медицине, в частности к биотехнологии, и может применяться в ревматологии, клинической иммунологии и других областях медицины.

Известен способ получения иммуносорбента путем фиксации антигена с носителем с использованием смеси фосфолипидного антигена в хлороформе и 0,5% -ном растворе полиметилметакрилата в объемном соотношении носителя и указанной смеси 1:1 (1). Предлагаемый способ получения иммуносорбента отличается как способом получения самого носителя, так и способом фиксации антигена с носителем.

В отличие от прототипа в предлагаемом способе получения сорбента в процессе иммобилизации антигена происходит ориентация его антигенных детерминант наружу, в сторону реакционной водной фазы, что значительно повышает сорбционную емкость иммуносорбента при равной включаемости антигена на носителе.

С другой стороны, получаемый сорбент отличается от прототипа также тем, что имеет стандартную сферическую форму диаметром 50-100 мкм, содержит ферромагнитный материал, получаемый не механическим измельчением, а методом эмульсионной полимеризации.

Сферическая поверхность сорбента и возможность использования сил магнитного поля (магнитных мешалок, катушек и т.п.) позволяет значительно увеличить площадь контакта с антигеном, что и дает возможность эффективнее проводить сорбцию (2), а также упрощает манипуляции с магносорбентом.

В прототипе использовались фосфолипидные антигены из желточного мешка, а не комплексный коммерческий препарат кардиолипинового антигена, выпускаемый Харьковским предприятием по производству бактериальных препаратов, который представляет собой смесь липидов, растворенных в абсолютном этаноле (кардиолипина 0,3% лецитина/фосфатидилхолина / 0,07% холестерина 0,9%).

Соотношение и состав данных липидов необходимо для формирования в водных растворах антигенных детерминант, т.е. тех участков, которые взаимодействуют с антифосфолипидными антителами с высокой степенью авидности (сродства).

Отличие от прототипа состоит также и в том, что получаемый сорбент находится в жидкой фазе, т.к. испарение хлороформа из его смеси и полиметилметакрилатом достигается путем постепенного прогревания эмульсии - воды и раствора полиметилметакрилата в хлороформе, а не путем высушивания сорбента в потоке воздуха, как указано при получении прототипа.

Таким образом, конечный продукт получается не в сухом виде а в форме суспензии и находится в жидкой фазе, что значительно облегчает манипуляции с сорбентом, так как исключает неизбежное слипание гранул полиакриламида, наблюдаемое при высушивании (2).

Цель изобретения повышение сорбционной емкости и эффективности сорбции при многократном использовании сорбента, создание сорбента, исключающего потери кардиолипинового антигена в реакционную среду при многократном использовании.

Поставленная цель достигается разработанным способом получения иммуносорбента путем связывания антигена с носителем, где в качестве антигена используют концентрированный кардиолипиновый антиген, а его связывание осуществляется обработкой носителя смесью раствора антигена в хлороформе и 0,5%-ного раствора полиметилметакрилата при объемном соотношении носителя и указанной смеси 1:1 с последующим испарением хлороформа путем постепенного прогревания суспензии вода и хлороформ до 60^oC (температура кипения хлороформа), при котором происходит пространственная ориентация гидрофильных фосфолипидных головок кардиолипинового антигена наружу, в сторону реакционной водной фазы и полное испарение хлороформа, в то время как остатки жирных кислот с гидрофобными свойствами будут ориентированы в сторону органической фазы.

В качестве фосфолипидного антигена используют комплексный кардиолипиновый антиген, выпускаемый Харьковским предприятием по производству бактериальных препаратов, после его предварительной концентрации.

В качестве носителя применяются заранее полученные полиакриламидные гранулы, имеющие стандартную сферическую форму, диаметр 50-100 мкм и содержащие ферромагнитный материал, которые получают методом эмульсионной полимеризации в потоке газообразного азота из мономеров акриламида с включением магнитного материала окиси железа (3).

На следующем этапе приготовленные гранулы высушивают, обезвоживают и вносят в раствор концентрированного антигена, предварительно растворенного в 0,5%-ном растворе полиметилметакрилата в хлороформе.

Таким образом, способ пространственно ориентированной иммобилизации комплексного кардиолипинового антигена на носителе позволяет достичь прочную фиксацию антигена на носителе без его потерь в реакционную среду (водную среду) при многократном использовании, а также повысить его сорбционную емкость и эффективность иммуносорбции.

Способ получения иммуносорбента путем связывания кардиолипинового антигена проясняется следующими примерами.

Пример 1. Получение кардиолипинового антигена. Концентрированный кардиолипиновый антиген получали из коммерческого препарата "Кардиолипиновый антиген для реакции микропреципитации" (Харьков, сер.2951-5К-122 /годность 3,88 лет/). Три ампулы по 2 мл раствора кардиолипина в абсолютном этаноле концентрировали до полного испарения в термостате при 37^oC в течении 48 ч.

Пример 2. Получение носителя методом эмульсионной полимеризации. Носитель на основе полиакриламида получали методом, описанным в (3). Полученные гранулы имели правильную сферическую форму, 50-100 мкм в диаметре и содержали не более 10% оксида железа. После этого обезвоживали сорбент абсолютным этанолом в течение 2 ч, после этого гранулы высушивали при комнатной температуре.

Пример 3. Связывание кардиолипинового антигена с носителем. Приготовленный концентрированный кардиолипиновый антиген в количестве 28 мг, вносили в 2 мл 0,5%-ного раствора полиметилметакрилата в хлороформе, доводя концентрацию липидов до 14 мг/мл, т.е. по сравнению с исходной концентрацией произошло концентрирование липидов в три раза. Полученный раствор смешивали с полиакриламидными гранулами в соотношении 1:1. Суспензию инкубировали в течение 3 ч на магнитной мешалке в термостате при 37^oC. После инкубации пропитанные в растворе антигена полиакриламидные гранулы вносили в 10 мл воды и энергично встряхивали для получения эмульсии вода/хлороформ. В пробирку с суспензией подавали газообразный азот под давлением 0,5 атм по трубке с сечением 0,5 мм, таким образом, чтобы создать интенсивное перемешивание в течении 15 мин.

Пробирку постепенно нагревали на водяной бане до температуры кипения хлороформа (60 ^oC) для его полного испарения. После исчезновения запаха хлороформа в растворе определялась концентрация несвязавшегося липида методом Лазарофа (4), которая составила 5 мг/мл, т.е. в носитель включалось 23 мг кардиолипина. В процессе фиксации антигена происходила пространственная ориентация липидных молекул на границе раздела двух фаз. После этого гранулы отмывали от несвязавшегося антигена 0,1 М фосфатно-солевым буфером,pH 7,4 с 0,05% ТВИН-20. Полученный иммуносорбент консервировали тиомерсалом- 1:10000 с добавлением антиоксиданта 0,01% альфа-токоферола.

Пример 4. Пример сорбции антифосфолипидных антител с использованием предлагаемого сорбента и его прототипа из крови женщин с хроническим невынашиванием беременности. Полиакриламидные гранулы с магнитными свойствами и иммобилизированным кардиолипином были получены методом, который описан выше. Прототип получали способом,указанным в (1). Для проведения сорбции 1 г сорбента вносили в колонку объемом 5 мл и перфузировали через нее 16 мл гепаринизированной крови женщин, страдающих хроническим невынашиванием беременности, в крови которых циркулируют антитела к фосфолипидным антигенам (5,6), со скоростью 8 мл/ч в течение 2 ч при 37^oC. Гранулы отмывали от несвязавшегося белка 0,1 М фосфатным буфером, pH 7,4, содержащим 0,15 М раствор натрия хлорида со спектрофотометрическим контролем при 280 нм до нулевых значений экстинции. Элюцию проводили 0,1 М глицин-HCI буфером, pH 2,8, два раза по 10 мин (4^oC); элюат нейтрализовали 1 М раствором двузамещенного фосфата калия, диализировали в течение 16 ч при 4 ^oC против 5 л 0,15 М раствора хлорида натрия и концентрировали до исходного объема. В элюате определяли общую концентрацию белка по Лоури (7).

В сыворотке крови до и после сорбции измеряли концентрацию антител к кардиолипину непрямым твердофазным иммуноферментным методом, как описано в (8). По этой методике провели сорбцию антител из крови 10 женщин, страдающих хроническим невынашиванием беременности, на разработанном сорбенте и его прототипе. В качестве контроля использовались сыворотки крови 10 практически здоровых лиц, у которых измерялась концентрация антител по указанной выше методике.

Результаты по измерению концентрации антител приведены в табл.1.

Доноры для всех составили M±m 0,061±0,0018.

Концентрация антител до сорбции была достоверно выше у больных, чем у доноров (p<0,001). После сорбции происходило ее снижение до уровня здоровых лиц (p<0,001) в первом случае, тогда как во втором, несмотря на достоверное снижение концентрации антител по сравнению с исходным уровнем (p<0,001) таких показателей достигнуто не было, соответственно различалась и сорбционная емкость, которая была примерно в два раза выше для разработанного метода получения сорбента по сравнению с прототипом, несмотря на равное использование антигенного материала в процессе иммобилизации кардиолипинового антигена.

Пример 5. Сорбция антител к кардиолипиновому антигену из плазмы крови больных системной красной волчанкой. По описанной выше методике была произведена сорбция антикардиолипиновых антител из плазмы крови больных СКВ с клиническими проявлениями фосфолипидного синдрома (8, 9). В качестве контроля использовались сыворотки крови 10 практически здоровых лиц. По ранее описанному методу до и после сорбции измеряли концентрацию антител непрямым твердофазным иммуноферментным методом. В элюате определяли концентрацию общего белка по Лоури.

Полученные результаты представлены в табл.2.

После сорбции на разработанном сорбенте происходило достоверное снижение концентрации антител до уровня здоровых лиц. Использование прототипа также сопровождалось достоверным снижением концентрации антител (p<0,001) по сравнению с исходным уровнем до сорбции, однако показатели не достигали уровня концентрации таковых у доноров и превышали их почти в два раза, что легко объяснить двукратным различием в сорбционной емкости предлагаемого иммуносорбента по сравнению с прототипом.

Пример 6. Регенерация и повторное использование гранул. После сорбции гранулы регенерировались 0,1 М глицин-HCl буфером, pH 2,8 или 3 М раствором роданида калия. После многократной регенерации потерей липидов в реакционную среду и изменения активности сорбента не наблюдалось.

Пример 7. Контроль специфичности сорбента. 1 г гранул смешивали с 4 мл сыворотки крови донора на магнитной мешалке. С интервалом 15 мин в ней определяли концентрацию белка по Лоури, иммуноглобулинов по Манчини классов G, A, M. Результаты представлены в табл.3.

Полученные данные говорят о низкой неспецифической сорбции сорбента и значительной сорбционной емкости, которые сохраняются при многократном использовании гранул получаемых по разработанной методике. Метод иммобилизации экономичен, так как при равном количестве используемого антигена происходит повышение сорбционной емкости примерно в два раза, а включение в гранулы ферромагнитного материала значительно облегчает манипуляции с сорбентом благодаря возможности использования сил магнитного поля (магнитных катушек, магнитных мешалок и т.п.), что и повышает эффективность сорбции, способствуя полному удалению антител к кардиолипину.

Конечный продукт получается в виде суспензии в водной фазе, а не в сухом виде, что исключает возможную адгезию и слипание полиакриламидных гранул при хранении и многократном использовании, а также дает возможность быстро проводить стерилизацию и консервацию сорбента, что важно для создания банков антигенной информации.

Таким образом, технико-экономическая эффективность заключается в возможности получения иммуносорбентов с высокими стандартными свойствами, которые стабильны при многократном использовании, позволяют неоднократно проводить сорбцию антикардиолипиновых антител без потери препарата за счет прочной фиксации кардиолипинового антигена.

Использованная литература:
1. Авторское свидетельство SU 1007 676 А, кл. A 61 К 47/00, 1983 (прототип).

2. Заводовский Б. В. Кочергин И.Ю. Сычева Г.Ф. Пути уменьшения травматичности процедуры экстракорпоральной иммуносорбции.//Тезисы докладов XII конференции молодых ученых, Волгоград, с.25. 1992.

3. Пушкарь В.Г. Ефременко В.И. Климов И.М. Гавенский С.Д. Трофимов Е.Н. Приготовление и применение магнитных сорбентов для изучения антигенов микроорганизмов. //М. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии, N 12, 30-35, 1985.

4. Lazaroff N. Uber eine Kolorimetrische Micrometode zur Bestimmung des. Iasamifettes im Blutserum.-Z.med.Labortechn, 1973, 14, N6, 377-379.

5. Насонов Е.Л. Антифосфолипидный синдром: клиническая и иммунологическая характеристика // Клиническая медицина.-1989-N1.-с.5-13.

6. Hugehes G R V.The anticardiolipin syndrom.-Clin Exp Rheumatol 1985, 3:285-6.

7. Lowry O.H. Rosenbrough A.L. Farr A.Z. Randall C.J. Protein mesurement with the Folin-phenol reagent.-J Biol.chem, 1952, 193, 265-275.

8. Harris E N. Garavi A E, Patel S P, Hughes GRV Evaluation of the fnticardiolipin fntibody test:report of an international workshop held 4 April 1986. Clin Wxp Immunol 1987; 68:215-22.

9. Paul E Love, MD, PhD; and Samuel A.Santoro, MD, Phd Antiphospholipid Antibodies: Anticardiolipin and the Lupus Erythematosus (SLE) and in Non-SLE Disorders.// Ann of Internal Medicine, 1990, v.112, N9, p.682-98.

Использование: биотехнология, медицина. Сущность изобретения: в способе получения кардиолипинового иммуносорбента проводят связывание полиакриламидного носителя - гранулярного полиакриламидного геля с концентрацией поперечно-сшивающего агента 25% и с включенным в него 10%-ным оксидом железа,с антигеном - коммерческим кардиолипиновым антигеном,сконцентрированным в три раза в соотношении 1:1, связывание осуществляют при постепенном нагревании до 60^oC до полного испарения хлороформа и выделяют целевой продукт. 3 табл.

Способ получения кардиолипинового иммуносорбента путем связывания полиакриламидного носителя с антигеном, смешанным с раствором полиметилметакрилата в хлороформе в соотношении 1 1 и выделения целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве носителя используют гранулярный полиакриламидный гель с концентрацией поперечносшивающего агента 25% и с включенным в него 10%-ным оксидом железа, в качестве антигена коммерческий кардиолипиновый антиген, сконцентрированный в три раза, а связывание осуществляют при постепенном нагревании до 60^oС до полного испарения хлороформа.