СПОСОБ АНТИГЕНСПЕЦИФИЧЕСКОЙ СУПРЕССИИ АНТИТЕЛОПРОДУКЦИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МАГНОСОРБЕНТА Российский патент 2001 года по МПК G01N33/544 

Изобретение относится к медицине, в частности к биотехнологии, и может применяться в ревматологии, клинической иммунологии и других областях медицины.

Многочисленными исследованиями показано, что состояние специфической (антиген-зависимой) неотвечаемости в ряде случаев может быть получено экспериментальным путем (1). В доступной литературе мы не нашли примеров антигенспецифической супрессии с помощью сорбентов. Однако, методически наиболее близким по эффективности и положительному результату иммуносорбции является разработанный способ извлечения антител к нативной дезоксирибонуклеиновой кислоте (анти-ДНК) (2). В то же время, использование этих прототипов делает невозможным достижение эффективной специфической супрессии продукции антител из-за адъювантных свойств полиакриламида и наблюдаемого в результате эффекта "рикошета" после проведения процедуры экстракорпоральной сорбции (3, 4).

Предлагаемый способ антигенспецифической супрессии анти-ДНК осуществляется с помощью гранулированного магносорбента на основе другого носителя - трисакрилового геля с ковалентно связанным с помощью глютарового альдегида IgG человека (сандоглобулин, производства SANDOZ FHARMA LTD, BASLE SWITZERLAND).

Включение ДНК происходит в процессе эмульсионной полимеризации сополимеров трисакрилового геля в потоке газообразного азота.

Полученный сорбент используется для получения эффекта антигенспецифической супрессии анти-ДНК путем проведения экстракорпоральной сорбции на иммунизированных лабораторных животных (кролики породы Шиншилла). После полного удаления антител к нативной дезоксирибонуклеиновой кислоте из крови животного эти же кролики использовались для повторной иммунизации ДНК-антигеном, по схеме, описанной ранее (3). Антитела к нативной ДНК определялись до и после сорбции, а также через 1, 2 и 4 недели после иммунизации методом непрямого иммуноферментного анализа, описанного в литературе (5).

В качестве контроля были использованы полиакриламидные гранулы с иммобилизированным антигеном нативной ДНК (2).

В результате, после повторной иммунизации не было получено ответа в группе животных с использованием разработанного типа сорбента, тогда как при использовании прототипа мы получали высокие титры антител к нативной ДНК, т. е. наблюдался феномен "рикошета".

Таким образом, предлагаемый способ гемосорбции с помощью разработанного типа сорбента воспроизводил антигенспецифическую супрессию продукции анти-ДНК, устраняя феномен "рикошета", наблюдаемый после сорбции с использованием прототипов, несмотря на повторную иммунизацию.

Предлагаемый способ антигенспецифической супрессии антител поясняется следующими примерами.

Пример 1. Получение носителя методом эмульсионной полимеризации.

В трех миллилитрах физиологического раствора растворяли 120 мг и 900 мг N, N'-диаллилтартрадиамид и N-акрилоил-2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиол, соответственно. В сосуд, содержащий 100 мл гексана (предварительно нагретый до 50^oC) и 0.5 мл СПЭН-85, подавали под давлением 1 атм газообразный азот по трубке сечением 08 мм, таким образом, чтобы создать интенсивное перемешивание в течение 5 мин. В колбу для полимеризации вносили 32 мг ДНК (Sigma Chemical Co., USA), растворенных в 3 мл ЗФР с 200 мг окиси железа с гидрофильными свойствами и 10 мг персульфата аммония, через 1-2 мин добавляли 3 мл физиологического раствора с растворенными в нем сомономерами трисакрилового геля и 25 мкл N,N,N',N'-тетраэтиленэтилендиамина. После завершения полимеризации гранулы отмывали ацетоном и ЗФР с ТВИН-20 (0.5%). Полученный сорбент имел правильную сферическую форму гранул диаметром 40-80 мкм и содержал включенный антиген ДНК и ферромагнитный материал. Сорбент обезвоживали абсолютным этанолом дважды по 20 мин и охлажденным ацетоном в течение 2 ч. Магносорбент на основе полиакриламида, содержащий ДНК, получали по методике, описанной ранее (2).

Пример 2. Ковалентное сшивание магносорбента с сандоглобулином.

10 мл ТРИС-NH₂ сорбента, полученного методом эмульсионной полимеризации, промывают на бюхнеровской воронке 3-4 объемами 0.5 М фосфатного буфера pH 7.6 (ФСБ). Затем магносорбент вносят во флакон с 10 мл 25%-ного водного раствора глютарата (величина pH раствора 7.4) и после инкубирования на водяной бане при 37^oC с периодическим встряхиванием промывают на бюхнеровской воронке 15-20 объемами ФСБ. Активированный сорбент используют для ковалентного связывания сандоглобулина по следующей методике: 5 мл магносорбента помещают во флакон с 10 мл 0.5 М фосфатного буфера pH 7.6, в котором растворен сандоглобулин в количестве 0.5 г. Магносорбент в количестве 5 мл инкубируют в течение 18 ч при 4^oC и промывают 1 объемом 0.1 М забуференного раствора этаноламина (pH 7.5-8.5) в течение 3 ч при 4^oC для блокирования оставшихся альдегидных групп.

Пример 3. Иммуносорбция антител с использованием разработанного типа сорбента.

Подготовку гранул к иммуносорбции в экспериментах in vivo проводили следующим образом. Гранулы 3 раза обрабатывали раствором глицин-HCl pH 2.5 по 10 мин, после чего отмывали 0.9%-ным раствором NaCl с контролем на спектрофотометре до значений экстинции меньше 0.05 на длине волны 205 нм. Далее гранулы помещали в колонку, соединяли с перистальтическим насосом и стерилизовали этанолом по методике, описанной выше. Стерилизацию ИГАП проводили 70% этиловым спиртом в течение 2 ч, после чего гранулы отмывались стерильным физиологическим раствором (Polfa-Kutno, Польша) до исчезновения следов этанола в отмывной жидкости (наличие этилового спирта определялось методом образования йодоформа, как описано ранее (6)). В качестве экспериментальных животных использовались кролики породы Шиншилла.

Перед проведением экспериментов in vivo была проведена иммунизация 20 лабораторных животных (кроликов) дезоксирибонуклеиновой кислотой (Sigma Chemical Co., USA) (3).

Иммуносорбцию in vivo проводили следующим образом. В стерильных условиях под нембуталовым наркозом (40 мг нембутала на 1 кг веса внутримышечно) проводилось выделение бедренного сосудисто-нервного пучка кролика. Бедренная артерия и вена канюлировались с помощью инъекционных игл и, таким образом, соединялись с перистальтическим насосом MICROPERPEX (LKB, Швеция). Далее животному внутривенно вводили 2500 ЕД гепарина. С помощью насоса кровь пропускали (направление тока крови из артерии в вену) со скоростью 125 мл/ч через колонку с 5 мл ИГАП, находящуюся внутри устройства для проведения иммуносорбции в магнитном поле в течение 2 ч. Далее, после перевязки сонной артерии, канюли извлекали из сосудов, останавливали кровотечение, накладывали швы на фасции и на кожу, обрабатывали операционную рану антисептиками и накладывали стерильную повязку. В послеоперационном периоде вводили антибиотики (бензилпенициллин 500000 ЕД в сутки 3 дня). Непосредственно до и после сорбции, а также через 1, 2 и 4 недели после нее определяли уровень антител к ДНК, после чего на 5 неделе начинали проводить повторную иммунизацию животных дезоксирибонуклеиновой кислотой с последующим определением анти-ДНК в крови опытной (разработанный сорбент) и контрольной групп (прототипы с ДНК) лабораторных животных.

Полученные результаты наблюдаемой динамики уровней определяемых антител сведены в таблицу.

Было отмечено повторное появление антител к нативной ДНК через 2-4 недели после гемосорбции с прототипом сорбента на основе полиакриламида, причем во второй группе животных практически до исходного уровня (феномен "рикошета") (таблица 1). В то же время, у животных уровень анти-ДНК оставался нормальным после сорбции с применением разработанного магносорбента (уровень антител к нативной ДНК у интактных животных составил 0.061 ± 0.003, соответственно, различия не достоверны p > 0.05 во всех случаях с применением разработанного сорбента), как в течение месяца до повторной иммунизации, так и после нее, в отличие от лабораторных животных, которым проводилась сорбция антител с использованием прототипа сорбента (таблица 1).

Таким образом, при наблюдении в контрольных группах наблюдался феномен "рикошета" - повторный подъем уровня анти-ДНК на второй и четвертой неделе после гемосорбции с использованием прототипов, который стал еще выше после повторной иммунизации в отличие от первой группы, где уровни антител к нативной ДНК оставались низкими несмотря на проведенную реиммунизацию (таблица 1).

Полученные данные говорят о наличии эффекта антигенспецифической супрессии анти-ДНК у животных в опытных группах.

Таким образом, разработанный магносорбент воспроизводит специфическую супрессию продукции антител к нативной ДНК и кардиолипину у лабораторных животных в отличие от прототипов.

Изобретение относится к медицине, в частности к биотехнологии, и может применяться в ревматологии, клинической иммунологии. Способ основан на использовании гранулированного магносорбента на основе трисакрилового геля с ковалентно связанным IgG человека. При этом используют магносорбент на основе гранулированного трис-акрилового геля, полученного методом эмульсионной полимеризации N - акрилоил -2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиола с применением в качестве поперечносшивающего агента N,N-диаллилтартрадиамида. Иммобилизацию антигена осуществляют при 50-60°С. Получают гранулы магносорбента правильной сферической формы диаметром 40-80 мкм, содержащие магнитный материал - оксид железа III и антиген ДНК. Способ позволяет достичь специфическую неотвечаемость у иммунизированных животных при повторной иммунизации нативной ДНК, а также устранить феномен рикошета, наблюдаемый в контрольной группе после экстракорпоральной элиминации анти-ДНК. 1 табл.

Способ антигенспецифической супрессии антителопродукции к нативной ДНК, отличающийся тем, что осуществляют иммуносорбцию с помощью ковалентно сшитого методом глутаровоальдегидной активации с иммуноглубулином G человека магносорбента на основе гранулированного трис-акрилового геля, полученного методом эмульсионной полимеризации N-акрилоил-2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиола с применением в качестве поперечносшивающего агента N', N-диаллилтартрадиамида, при этом N-акрилоил-2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиол и N, N'-диаллилтартрадиамид используют в концентрации 300 и 40 мг/мл соответственно, иммобилизацию антигена проводят при 50 - 60^oC с получением магносорбента в виде гранул правильной сферической формы диаметром 40 - 80 мкм, включающих ферромагнитный материал и антиген ДНК.