СПОСОБ ОЧИСТКИ КРОВИ ОТ РЕВМАТОИДНОГО ФАКТОРА Российский патент 1995 года по МПК G01N33/543 A61K39/385 

Изобретение относится к области медицины, а именно к экстракорпоральным методам извлечения специфических антител из крови и может применяться в ревматологии и биотехнологии.

Известно, что ревматоидный фактор, представляющий собой антитела к Fc-фрагменту нормального IgG человека, непосредственно участвует в развитии иммунокомплексного васкулита при ревматоидном артрите. Проявления последнего часто выходят на ведущее место в клинической картине заболевания, определяют его тяжесть и неблагоприятный прогноз.

Известен способ удаления указанных антител методом этапного плазмафереза, при котором проводится удаление плазмы больного в экстракорпоральном контуре малыми порциями по 300 мл с последующей инфузией пациенту изотонических солевых растворов и изоонкотических донорских белковых препаратов. Недостатком указанного способа является его низкая избирательность. При проведении процедуры вместе с ревматоидными факторами удаляются альбумин, гормоны, транспортные белки, нормальные иммуноглобулины, лекарственные препараты и т.д. В то же время проводимая в ходе плазмафереза инфузионная терапия не обеспечивает адекватного плазмозамещения. Используемые с этой целью в больших количествах (до 60% от общего объема) белковые препараты (альбумин, протеин, плазма) являются чужеродными для организма больного и вызывают его дополнительную сенсибилизацию. Кроме того, их высокая цена повышает стоимость метода и препятствует его широкому использованию.

Наиболее близким к предложенному по принципу действия и достигаемому результату является способ удаления ревматоидных факторов из крови путем пропускания ее через иммуносорбент, представляющий собой нерастворимый инертный носитель (агарозный гель в форме сефарозы CL-2В или сефарозы CL-4В), к которому после активации бромцианом ковалентно пришивается нативный или химически модифицированный иммуноглобулин G человека.

Указанный способ имеет ряд недостатков. Сефароза имеет крайне высокую стоимость и поэтому не может найти широкого применения для приготовления иммуносорбентов в клинической практике. Бромциан, используемый для активации данного носителя, является высокотоксичным соединением, работа с ним представляет опасность для исследователя. При приготовлении сефарозы из агарозы существенная часть активных групп носителя, к которым впоследствии присоединяется иммуноглобулин G, блокируется поперечной сшивкой геля. В процессе образования ковалентных связей между матрицей и лигандом происходит частичное блокирование активных центров молекулы антигена.

Вследствие указанных причин плотность антигенных детерминант на поверхности иммуносорбента, используемого в прототипе, оказывается недостаточной, что приводит к недостаточной эффективности удаления ревматоидных факторов из крови.

Цель изобретения - повышение степени очистки крови от ревматоидного фактора.

Поставленная цель достигается путем пропускания крови через иммуносорбент с иммобилизованным нативным IgG человека, причем в качестве иммуносорбента используют железосодержащие полиакриламидные гранулы с иммобилизованным в трехмерную решетку геля методом эмульсионной полимеризации нативным IgG человека.

П р и м е р 1. Получение полиакриламидных гранул с магнитными свойствами с иммобилизованным нативным иммуноглобулином G человека.

В 2 мл 0,15 М раствора натрия хлорида растворяли соответственно 100 мг и 300 мг метиленбисакриламида и акриламида (Реанал, Венгрия), а также 40 мг нативного иммуноглобулина G человека, полученного по известной методике из плазмы крови человека. Выбор концентрации антигена 20 мг/мл (В 2 мл - 40 мг) обусловлен тем, что в прототипе именно эта концентрация белка дала возможность получить иммуносорбент, удаляющий антитела с максимальной эффективностью.

В сосуд, содержащий 100 мл гексана и 0,5 мл эмульгатора СПЭН-85, подавали под давлением 0,2-1 атм газообразный азот по трубке сечением 0,8 мм таким образом, чтобы создавать интенсивное перемешивание в течение 5 мин. В колбу для полимеризации вносили 1 мл физиологического раствора с 200 мг окиси железа с гирофильными свойствами и 10 мг персульфата аммония, через 1-2 мин добавляли 2 мл раствора, содержащего мономеры акриламида, метиленбисакриламида, IgG человека и 20 мкл NNN'N' -тетраметилэтилендиамина (ТЭМЭД).

После завершения полимеризации гранулы в течение 10-15 мин отмывали ацетоном и физиологическим раствором с детергентом Твин-20 (0,05%) от непрореагировавших мономеров, эмульгатора и гексана. Гранулы имели стандартную сферическую форму с размером частиц геля 10-100 мкм. Соотношение полимерный носитель - железо = 2:1 (в пересчете на сухую массу).

П р и м е р 2. Сорбция ревматоидного фактора из плазмы крови больного ревматоидным артритом.

1 мл полученных полиакриламидных гранул инкубировали 1 ч при 37^оС на магнитной мешалке с 2 мл плазмы больного ревматоидным артритом, титр ревматоидного фактора в которой составлял 1:2560 в реакции Ваалера-Роузе или 1: 10240 в реакции латекс-агглютинации. Впоследствии гранулы отделялись от плазмы и отмывались 0,1 М фосфатным буфером рН 7,4 до нулевых значений экстинции на спектрофотометре (длина волны 280 нм).

Десорбция антител проводилась 0,1 М глицин-HCl буфером рН 2,5 два раза по 10 мин. Элюат нейтрализовали 1 М К₂НРО₄, концентрировали до объема 2 мл, диализовали против 5 л 0,1 М фосфатного буфера рН 7,4 в течение 18 ч при 4^оС. В истощенной сыворотке определялся титр ревматоидного фактора в реакции Ваалера-Роузе и методом латекс-агглютинации.

По описанной методике проведена сорбция 10 образцов плазмы больных ревматоидным артритом. В качестве контроля использовали 10 сывороток крови практически здоровых лиц. Полученные результаты и их сравнительная характеристика с прототипом приведены в таблице.

Из результатов видно, что предложенный сорбент истощает в 2,5 раза большее количество плазмы, чем прототип, при этом степень снижения титра антител остается прежней.

П р и м е р 3. Регенерация и повторное использование сорбента.

После сорбции гранулы регенерировались 0,1 М глицин-HCl буфером рН 2,5 или 3 М раствором роданида калия (КСNS). После первой регенерации потеря специфической активности составила 14%, при последующей регенерации (до 8 раз) потери активности не происходило.

П р и м е р 4. Контроль специфичности сорбента.

1 г Предложенного сорбента совмещали с 2 мл сыворотки крови донора, не содержащего ревматоидных факторов. С интервалом 15 мин в течение 1 ч в ней определяли концентрацию белка по Лоури, иммуноглобулинов классов G, A, M по методу Манчини. Достоверных отличий по сравнению с исходным уровнем отмечено не было. Полученные данные говорят о низкой специфичности емкости сорбента.

Таким образом, предлагаемый сорбент позволяет достигнуть увеличения специфической активности по сравнению с прототипом в 2,5 раза. Он инертен, имеет низкую неспецифическую емкость, может регенерироваться и повторно использоваться без существенной потери сорбционных свойств. При изготовлении данного иммуносорбента используются более доступные и дешевые материалы по сравнению со сравниваемым образцом. Иммобилизация антигена методом эмульсионной полимеризации позволяет за один этап провести как синтез носителя, так и иммобилизацию на нем специфического лиганда. Включение магнитного материала позволяет поддерживать гранулы во взвешенном состоянии во внешнем магнитном поле, за счет чего уменьшается утечка сорбента за пределы колонки, повышается площадь соприкосновения его с кровью, уменьшается гемодинамическое сопротивление экстракорпорального контура. Предлагаемый иммуносорбент может использоваться для удаления специфических антител из биологических жидкостей. Его высокая специфичность и эффективность позволит расширить показания к проведению процедуры и улучшить эффект от нее, что будет способствовать улучшению прогноза, снижению инвалидности и увеличению средней продолжительности жизни при ревматоидном артрите. Применение метода позволит получить экономический эффект за счет уменьшения сроков госпитализации больных и возможности повторного использования гранул.

Использование: медицина, ревматология и биотехнология для экстракорпорального извлечения специфических антител из крови. Целью изобретения является повышение степени очистки крови от ревматоидного фактора. Сущность изобретения: кровь пропускают через иммуносорбент, в качестве которого используют полиакриламидные гранулы с магнитными свойствами с иммобилизованным в трехмерную решетку геля методом эмульсионной полимеризации нативным Ig G человека. Сорбент позволяет повысить эффективность способа в 2,5 раза по сравнению с прототипом (сефароза CL - 4В, активированная бромцианом с фиксированным на ней ковалентной связью нативным Ig G - человека), а также снизить его стоимость за счет использования более доступных и дешевых материалов. Способ отличается высокой специфичностью и эффективностью. Его практическое применение позволит расширить показания к проведению иммуносорбции и повысить эффект от нее, что будет способствовать улучшению прогноза, снижению инвалидности и увеличению средней продолжительности жизни больных ревмотоидным артритом. 1 табл.

СПОСОБ ОЧИСТКИ КРОВИ ОТ РЕВМАТОИДНОГО ФАКТОРА, включающий пропускание ее через сорбент, представляющий собой полимерный носитель с иммобилизованными нативными иммуноглобулином G человека, отличающийся тем, что в качестве сорбента используют железосодержащие полиакриламидные гранулы, полученные в результате эмульсионной полимеризации метиленбисакриламида с акриламидом в присутствии N, N, N', N' - тетраметилэтилендиамина, порошка окиси железа и иммуноглобулина G-человека, причем соотношение полимерный носитель: окись железа в сорбенте составляет 2:1, а размер гранул - 10-100 мкм.