Способ получения иммуносорбента Советский патент 1983 года по МПК A61K47/00 

СХ)

|

Од Изобретение относится к медицине а именно к медицинской микробиологи и может быть использовано для выдел ния специфических антител, применяе мых в диагностике ряда инфекционных заболеваний. Известен способ получения иммуносорбента путем обработки кремнийсодержащего -неорганического носител j-амииопропилтриэтоксисиланом; моди фикации полученного носителя глутаровым альдегидом с последзющим ковалентным связыванием его с белком. Иммуносорбент применяется для выделения чистых антител из сыворот ки 1, . Однако кратность использования иммуносорбента составляет . Известен способ полумения иммуно сорбента путем включения антигена а полиакриламидный гель проведением совместной полимеризации акрильных мономеров с общей концентрацией их до 12% в присутствии антигена и ини циаторов полимеризации с последующе дополнительной сшивкой предваритель но фиксированного антигена глутаров альдегидом. Вводимый в гель антиген в данном случае используют в ви де следующего комплекса - дифтерийный токсин- антитоксин из нативной культуральной жидкости дифтерийной палочки и нативной противодифтерий.ной сыворотки 2, Однако способ не обеспечивает вы сокой стабильности получаемых иммуносорбентов. В процессе использования после 10-13 кратного использова ния значительно снижается их специф ческая активность, что связано как с ухудшением колоночных свойств инертного носителя, так и недостато но прочной фиксацией на нем антигенаЦель изобретения - повышение стабильности получаемого иммуносор, бентао Поставленная цель достигается способом получения иммуносорбента путем связывания с носителем, где в качестве антигена используют фос фолипидный антиген и связь ван 4е осуществляют .обработкой носителя смесью раствора антигена в хлоформе и 0,5±0,OU;-ro раствора полиметилакрилата в хлороформе при объемном соотношении носителя и ука занной смеси 1;1 с последующим высу шиванием полученного продукта. Предпочтительно используют фосфолипидные антигены риккетсий или хламидий, В качестве носителя обычно используют полиакриламидный гель, или растворимый крахмал, или сефарозу 4В. Способность фосфолипидных антигенов растворяться в хло Ьоформе, не меняя своей специфической активности, дает возможность иммобилизовать их на носителе с помощью растворенного в хлороформе полиметилметакрилата ( плексигласа). В результате достигается не только прочная фиксация антигена на носителе, но и за счет плексигласа значительно улучшаются колоночные свойства инертного носителя- увеличивается его стабильность, .Кратность -использования до 53 раз, В качестве исходного ма-. териала для извлечения фосфолипидных антигенов используют желточные мешки куриных эмбрионовf инфицированных соответствующими микробными штаммамиf например, возбудителем сыпного тифа риккетсиями. Провачека, Желточные мешки гомогенизируют и из гомогената извлекают антиген по известной методике Гз . . П р и м е р 1 . 1риготовленный антяген растворяют в хлороформе- из рас чета 1 мл на 1 желточный мешок.После чего его смешивают с равным объемом раствора плексигласа в хлороформе. Ранее готовят полиакрил амидный гель (50 мл)„ С этой целью N,N-метилен-бис-акриламид 1,625 г растворяют в 25 мл дистиллированной воды при fO°C в течение 30 мин, К полученному раствору добавляют ,2,5 г акриламида, затем последовательно вносят инициаторы сополимеризации: 0,05 г персульфата аммония и 0,25 мл 10 раствора на дистиллированной воде N, N, N, М- тетраметилэтилендиамина. Приготовленный полиакриламидный гель измельчают, просеивая через капроновое сито, промывают ацетоном и хлороформом. Затем к одному объему носителя полиакриламидному гелю добавляют равный объем полученной смеси антиген плексиглас5 тщательно перемешивают и высушивают в токе воздуха до исчезновения запаха растворителя. Полученный Иммуносорбент используют для выделения антител к риккетсиям Провачека (пример 2), Аналогичным обраЗОЙ готовят иммуносорбенты на фосфоЬипиднух антигенах других микробов, например хламидий.

П р и м е р 2, Выделение антител к риккетсиям Провачека из лошадиной антисыворотки.

Сухой иммуносорбент суспендируют в физиологическом растворе рН 7,0 и . заполняют колонку (100 ммх2;э мм). Колонку симмуносорбентрм промывают физиологическим раствором рН 7,0 до нулевой экстинкции. На колонку наслаивают антисыворотку к риккетсиям Провачека и пропускают ее через слой иммуносорбента в течение 30 мин. После .полного отмывания физиологическим раствором рН 7,0 несвязавшегося белка, сорбированные антитела элюируют. Элюцию проводят

одним из общепринятых способов, ,в частности 0,1М буферным раствором КС1-глицина при рН 2,5 с последующей нейтрализацией раствора.

Выделенные чистые антитела к

риккетсиям Провачека обладают высокой удельной специфической активностью. Коэффициент очистки составляет ,5, гПри этом белок определяют на спектрофотометре СФ-16, а ГЕ (гемогглвтинирующая единица) определяют в реакции непрямой гемогглютинации.

Т а б л и ц а 1

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ HfWHG СОРБЕНТА пУтём связывания антигена с носителем, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью повышения стабильности ,. в качестве антигена используютфосфолипидный антиген и связывание осуи ствляют обработкой носителя смесью раствора антигена в хлороформе и 0,5±0,01% раствора полиметилметакрилата в хлороформе при объемном соотношении носителя и указанной смеси 1:1 с последующим высушиванием пояученнопо продукта. 2,Способ по п, 1, о т л и ч а ющ и и с я тем, что используют фосфолипидные антигены риккетсий или хламидий.. 3.Способ по п, 1, о т л и ч а юV) щ и и с я тем, что в качестве носителя используют полиакриламидный гель или растворивши крахмал, или сефароЗУ 4В.

П Ри м е р 3. Получение иммуносорбента для выделения чистых антител к риккетсиям Музера, Исходным материалом для получения фосфолипидного антигена слу- . жат инфицированные риккетсиями Музера штамм Исаханян желточные оболоч ки куриных эмбрионов-(титр возбудите ля lO,J1fl5Q- 0,2 мл при введении в желточный MeiuoKJl Желточные оболочки гомогенизируют и из голорена извлекают антиген по методу ЗЪ Полученный антиген растворяют в хлороформе из расчета 1 мл на 1 желточный мешок. Затем его смешивают с равным объемом 0,5 раствора плексигласа в хлороформе. Ранее готовят полиакриламидный гель, как описано выше. 1риготовленный полиакриламидный гель измельчают, просеивая через капроновое сито, промывают ацетоном и хлороформом Затем к одному объему носителя - поли а криламидному гелю добавляют равный .объем полученной смеси антиген плексиглас, тщательно перемешивают и высушивают в токе возду а до исчезновения запаха растворителя Полученный иммуносорбент используют для выделения препаратов к риккетсиям Музера, П р и м е р 4. Получение иммуносорбента для выделения чистых антител к риккетсиям Сибирика. В качестве исходного материала для получения фосфолипидного антигена применяют инфицированную рик- кетсиями Сибирика штамм К-1 ткань селезенки и брюшины белых мышей, зараженных внутрибрюшинно. Перед заражением белым мышам весом г (за -5 ч) внутримышечно вводят гидрокортизон по 2,5 мг на одну МЫШЬ. Накопление возбудителя конт-. ролируют микроскопией мазков-отпечатков, окрашенных по Романовскому Гимза. В опыте используют материал с крестным накоплением возбудителя. Извлечение антигена осуществляют по методу СЗ 1олученный антиген растворяют в хлороформе из расчета 1 мл на органы от одной белой мыши. Последующие этапы получе . ния иммуносорбента проводят, как ук зано в примере 1. ,П р и ме р 5. Получение иммуносорбента для выделения чистых к возбудителю энзоотического аборта овец. Исходным материалом для извлечения фосфолипидного антигена служат желточные оболочки куриных эмбрионов, зараженных возбудителем энзоотического аборта овец штамм ЕАЕ. Титр возбудителя должен быть не менее 10 ЛДсо(0,2 мл при заражении в желточный мешок ). Выделение антигена и получение иммуносорбента проводят, как указано в примере 1, Г р и м е р 6. Получение иМмуносорбента для выделения чистых антител к возбудителю венерической лимфогранулемы. Для получения фосфолипидного ант гена используют желточныеоболочки развивающихся куриных эмбрионов, инфицированных возбудителем венерической лимфогранулемы штамм ЛГВ. Титр возбудителя в исходной взвеси должен составлят ь 10 Щ.(0,25 мл при введении в желточный мешок), Да льнейшая обработка материала и получение иммуносорбента осуществляется , как указано в примере 1. П р и м е р 7 . Получение иммуно сорбента на основе сефарозы В. для выделения антител к R. prowafzektii . Из желточной культуры риккетсий Провацека готовят фосфолиПидный антиген (методика примера 1).Полученный антиген растворяют в хлороформе из расчета 1 мл на 1 желточный мешо Растворенный антиген смешивают с pa ным объемом 0,5 раствора мелкой стружки полиметилметакрилата в хлор форме. Приготовленную смесь соединяют с равным объемом сефарозы kB (фцрма Pharinacia) рпредваритепьно. обезжиренной хлороформом ...Полученную смесь тщательно перемешивают и высушивают в токе воздуха до полного ис чезновения запаха растворителя. Получение иммуносорбента проводят при 18-22 С. П р и м е р 8о Получение иммуносорбента на основе сефарозы kB для в ыделения антител .к Ch. psittacl. Из желточной культуры возбудителя орнитоза, тем же способом готовят фосфолипидный антиген. Полученный антиген растворяют в хлороформе из расчета 1 мл на 1 желточный мешок. Остальные операции проводят КИМ же образом, как в примере 1. П р и м е р 9 . Получение иммуносорбента на основе крахмала растворимого (ГОСТ 10бЗ-б2,. Реахим) для выделения антител к R. prowazeku. . Из желточной культуры риккетсий Провачека готовят, фосфолипидный антиген (тем же способом). Полученный антиген растворяют в хлороформе из расчета 1 мл на 1 .жел.точный мешок. Растворенный антиген смешивают с равным объемом 0,i)% раствора мелкой стружки полиметилметакрилата в хлороформе. Приготовленную смесь соединяют с равным объемом крахмала растворимого, предварительно обезжиренного хлороформом. Полученную смесь тщательно перемешивают и высушивают в токе воздуха до полного исчезновения запаха растворителя. Все перечисленные операции проводят при 18-22е, П р и м е р 10. Получение иммуносорбента на основе крахмала растворимого (ГОСТ 1063-62. Реахим) для выделения антител к Ch. psittaci. Все операции проводят аналогичным образом с той лишь разницей, что работают .с фосфолипидным антигеном возбудителя орнитоза. Для извлечения специфических антител соответствующий иммуносорбент суспендируют в физиологическом растворе рН 7,0 и заполняют колонку. Последующие этапы работы изложены ранее (пример 2). В табл, 2 приведены результаты сравнительного применения иммуносорбентов, приготовленных на основе различных инертных носителей, дл выделения антител к риккетсиям Провачека и хламидиям орнитоза.

Полиакриламидный гель К риккетсиям Провачека

К хламидиям орнитоза

Цв

К риккетсиям Провачека

К хламидиям орнитоза

растК риккетсиям

, Таким образом все приготовленные иммуносорбенты отличакзтся достаточно высокой специфической активностью.

Иммуносорбент

Иммуносорбент для выделения антител к риккетсиям Провач Известный способ Предлагаемый - Иммуносорбент для выделения антител к возбудителю орнит Известный способ Предлагаемый - Иммуносорбент для выделения тел к риккетсиям Музера Известный способ Предлагаемый - Иммуносорбент для выделения тел к риккетсиям Сибирика Известный способ Предлагаемый.-МИммуносорбент для выделения тел к возбудителю энзоотиче аборта овец Известный способ Предлагаемый a б л и ц a 2

820

32,1 516

30,7 37. 536,8 31,9

Сравнительные данные по стабильности получаемых иммуносорбентов (носитель - полиакриламидный гель) приведны в табл. 3.

ТаблицаЗ

Кратность использования

12 51

13

9 «7

9

16 53

31007676,0

В табл. k приведены результаты кетсиям и хламидиям орнитоза в сравмногократного применения иммуносор- . нении с иммуносорбентами, полученны бантов для выделения антител к рик- ми известным способом.

Т а б л и ц а 4