СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 1998 года по МПК C08B37/08 

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается способа получения гиалуроновой кислоты, которая применяется в различных областях медицины, в том числе в дерматологии, гинекологии, офтальмологии, в косметической практике и в ветеринарии.

Известны способы получения гиалуроновой кислоты из петушиных гребней. Общим для методов получения гиалуроновой кислоты является последовательное разрушение структур на каждом уровне локализации (тканевом, клеточном, молекулярном). Для обеспечения максимального контакта с экстрагентами проводят измельчение и гомогенизацию тканей. Разрушение клеточных структур обычно проходит с использованием ферментов и органических растворителей. Высвобождение гиалуроновой кислоты из комплексов с другими полисахаридами и белками осуществляется с помощью ферментов, органических растворителей, детергентов целенаправленным воздействием на те или иные связи, удерживающие ее в комплексе.

Известен способ получения гиалуроновой кислоты, согласно которому гиалуроновую кислоту получают из петушиных гребней путем обескровливания сырья смесью этанола и хлороформа, с последующей повторной экстракцией водой, депротеинизацией экстракта хлороформом в присутствии NaCl при 4 25^oC в течение 3 5 ч, отделением водной фазы многократной экстракцией хлороформом или обработкой проназой и осаждением гиалуроновой кислоты этанолом. Выход препарата составляет около 0,08% от массы сырья. Эта гиалуроновая кислота является очень дорогим препаратом с высокой степенью очистки и применяется, в основном, в глазной хирургии. Данная технология послужила основой для разработки первого фармацевтического препарата "Hea lon".

Гиалуроновая кислота, используемая в составе разнообразных медицинских, фитотерапевтических, гигиенических, ветеринарных и косметических препаратов, не требует такой высокой степени очистки, как для применения в офтальмологии, поэтому способ извлечения ее может быть упрощен.

Наиболее близким к заявляемому способу прототипом является способ получения гиалуроновой кислоты по авторскому свидетельству СССР N1616926. Гиалуроновую кислоту получают из петушиных гребней следующим образом: сырье обескровливают, измельчают, экстрагируют водой при 90 100^oC, после термообработки экстракционную массу охлаждают до 4 60^oC в течение 2 4 ч, отделяют липиды, массу фильтруют, отделяют осадок сырья, а в фильтрат вводят активированный уголь в количестве 1 2% от массы исходного сырья, перемешивают 1 2 ч, смесь фильтруют, полученный фильтрат смешивают с осадком сырья и проводят двухстадийную экстракцию водой в течение 18 24 ч при 20 - 22^oC в присутствии пенициллина в количестве 0,05 0,07% от массы исходного сырья с последующей сушкой экстракта. Выход препарата составляет 3,8 4% по отношению к массе исходного сырья.

Недостатками известного способа получения гиалуроновой кислоты является использование в качестве экстрагента дистиллированной воды. Известно, что при выделении из ткани гиалуроновой кислоты водой вместе с гиалуроновой кислотой экстрагируются и нуклеиновые кислоты. Кроме того, данный метод предусматривает термообработку при 90 100^oC, что нежелательно, поскольку гиалуроновая кислота чувствительна к нагреванию и кипячение даже в течение незначительного времени приводит к необратимым изменениям ее свойств.

С целью отделения белка и высвобождения гиалуроновой кислоты из ее комплексов с белками и другими мукополисахаридами авторы используют активированный уголь, хотя известно, что связи гиалуроновая кислота белок достаточно прочны и разрушить их можно лишь органическими растворителями.

При разработке наиболее рационального способа получения гиалуроновой кислоты следует учитывать чувствительность ее как полимера к различным внешним воздействиям и избегать процедур, способных вызвать деполимеризацию. Между тем, все известные способы препаративного получения гиалуроновой кислоты включают приемы, неизбежно ведущие к ее деполимеризации. Поэтому при обосновании способа выделения гиалуроновой кислоты необходимо учитывать следующие моменты:
1. В процессе получения сырья надо исключить возможность наличия гиалуронидазы и предупредить энзиматическую деградацию гиалуроновой кислоты.

2. Поскольку гиалуроновая кислота чрезвычайно чувствительна к сдвигам pH и температуре, при которой происходит экстракция, необходимо провести эксперименты для выбора оптимального режима экстракции.

3. При выделении гиалуроновой кислоты необходимо предупредить возможность загрязнения ее нуклеиновыми кислотами. Так как нуклеиновые кислоты экстрагируются вместе с гиалуроновой кислотой из ткани, предпочтительно использовать экстрагент, в котором нерастворимы ядерные нуклеопротеиды.

4. В связи с наличием белка в экстрактах, содержащих гиалуроновую кислоту, используют органические растворители. Известно, что разрушение уникального природного комплекса гиалуроновая кислота белок при выделении из петушиных гребней совершенно не обязательно в случае применения ее препаратов в дерматологии, ветеринарии и косметологической практике. Имеются убедительные данные о том, что высокого терапевтического эффекта удается достигнуть не только не освобождая препараты гиалуроновой кислоты от белковых веществ, но наоборот, вводя в них дополнительно различные белки. Показано, что присутствие белка в препаратах гиалуроновой кислоты повышает их стабильность, биодоступность.

Задачей изобретения является разработка способа выделения гиалуроновой кислоты, не деполимеризованной, свободной от нуклеиновых кислот и содержащей комплекс натуральных белков.

Сущность предлагаемого способа получения гиалуроновой кислоты.

У петухов, достигших половозрелого возраста, срезают гребни, тщательно промывают от крови. Затем для инактивации гиалуронодазы гребни промывают горячей водой (при температуре свыше 60^oC в течение 20 30 мин). Промытые гребни измельчают в гомогенизаторе. Измельченное сырье помещают в емкость и заливают физиологическим раствором в соотношении 1:5, тщательно перемешивают в течение 1 ч для обеспечения максимального контакта ткани с экстрагентами и нагревают до кипения, удаляют образовавшийся на поверхности слой липидов, охлаждают, фильтруют. Осадок сырья вновь заливают физиологическим раствором в соотношении 1: 3, нагревают до 80 90^oC, охлаждают, фильтруют, экстракты объединяют. Для осаждения гиалуроновой кислоты в экстракт при постоянном перемешивании медленно добавляют 1 2%-ный раствор уксусной кислоты, оставляют до полного формирования осадка, надосадочную жидкость удаляют. Осадок помещают в емкость, заливают дистиллированной водой в соотношении 1:2, тщательно перемешивают, доводят pH до значения 7,0 -7,3, нагревают до температуры 80^oC. Смесь фильтруют или центрифугируют. Фильтрат лиофилизируют.

Новыми признаками способа выделения гиалуроновой кислоты по сравнению с прототипом являются:
использование в качестве экстрагента физиологического раствора, что предупреждает возможность загрязнения препарата нуклеиновыми кислотами;
проведение процесса при значении pH 7,0 7,3;
проведение процесса в щадящем температурном режиме: медленное нагревание экстракта до 80 90^oC;
отсутствие стадии очистки препарата от белка.

Как видно из табл. 1, 2, получаемый по предлагаемому способу препарат не содержит нуклеиновых кислот, не подвергается деполимеризации, имеет более продолжительный срок хранения и, таким образом, обладает более высоким качеством, чем препарат, получаемый по способу-прототипу.

Совокупность всех перечисленных признаков экспериментально разработана авторами, не известна из опубликованных источников информации, что позволяет сделать вывод о существенных отличиях предлагаемого метода от известных и соответствии критериям "новизна" и "изобретательский уровень".

Изобретение иллюстрируется следующими примерами, подтверждающими возможность его осуществления.

Пример 1. Способ получения гиалуроновой кислоты. В качестве сырья используют петушиные гребни. У петухов, достигших половозрелого возраста, срезают гребни, тщательно промывают от загрязнений холодной водой, затем обрабатывают в течение 30 мин водой при температуре свыше 60^oC. Отмытые от крови во избежание окислительной деструкции гребни (0,5 кг сырья) измельчают в гомогенизаторе, заливают 2,5 л физиологического раствора, перемешивают в течение 1 ч и нагревают при 80 90^oC, удаляют образовавшийся на поверхности слой липидов, фильтруют через несколько слоев марли, в фильтрат добавляют 1%-ный раствор уксусной кислоты в количестве 50 -60 мл, оставляют до полного формирования осадка, надосадочную жидкость удаляют. Осадок заливают 1 л дистиллированной воды, тщательно перемешивают и раствором едкого натра доводят pH до значения 7,0 -7,3, нагревают до 80^oC, фильтруют, фильтрат лиофилизируют.

Получают 17,5 г гиалуроновой кислоты, что составляет 3,5% от массы исходного сырья.

Пример 2. Способ получения гиалуроновой кислоты. 500 г сырья (полученного, как указано в примере 1) гомогенизируют, заливают 2,5 л физиологического раствора, перемешивают в течение 1 ч, нагревают при 80 - 90^oC, удаляют липиды, фильтруют. Осадок сырья вновь заливают 1,5 л физиологического раствора, нагревают при 80 90^oC, фильтруют. Экстракты объединяют и медленно при постоянном перемешивании добавляют 1%-ный раствор уксусной кислоты из расчета 20 мл на 1 л, оставляют до полного формирования осадка, надосадочную жидкость удаляют, осадок заливают 1 л дистиллированной воды, тщательно перемешивают и 0,1%-ным раствором едкого натра доводят pH до значения 7,0 7,3, нагревают до 80^oC, фильтруют, фильтрат лиофилизируют. Получают 20 г гиалуроновой кислоты, что составляет 4,0% от массы исходного сырья.

Пример 3. Способ получения гиалуроновой кислоты. У петухов, достигших половозрелого возраста, срезают гребни у основания, тщательно промывают от загрязнений холодной водой, затем обрабатывают в течение 20 мин водой при 80^oC. Отмытые гребни измельчают до получения фарша с размером частиц не более 1 мм. 500 г сырья заливают 2 л физиологического раствора, перемешивают 30 мин, нагревают до кипения, удаляют образовавшийся на поверхности слой липидов, фильтруют. Осадок сырья вновь заливают 2 л физиологического раствора, нагревают до кипения (но не кипятят), фильтруют. Экстракты объединяют, медленно при постоянном перемешивании добавляют 2%-ный раствор уксусной кислоты, оставляют до полного формирования осадка, надосадочную жидкость удаляют. Осадок заливают 1 л дистиллированной воды, тщательно перемешивают и 0,1% -ным раствором едкого натра доводят pH до значения 7,0 7,3, медленно нагревают до кипения, фильтруют, фильтрат лиофилизируют. Получают 24 г гиалуроновой кислоты, что составляет 4,8% от массы исходного сырья.

Разработанный способ получения гиалуроновой кислоты достаточно прост, не требует дорогостоящего оборудования и реактивов. Гиалуроновая кислота может быть использована в качестве источника получения высокоочищенной гиалуроновой кислоты для офтальмологии, а также в производстве препаратов для дерматологии и косметологии. Петушиные гребни являются одним из наиболее перспективных видов сырья вследствие их доступности и возможности организации крупномасштабного производства гиалуроновой кислоты.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается способа получения гиалуроновой кислоты, которая применяется в различных областях медицины, в том числе в дерматологии, гинекологии, в косметической практике и в ветеринарии. Изобретение позволяет упростить способ получения гиалуроновой кислоты, увеличить степень ее очистки от нуклеиновых кислот, повысить качество продукта за счет того, что петушиные гребни, отмытые от загрязнений и крови, гомогенизируют, проводят последовательную двухстадийную экстракцию сырья физиологическим раствором при 80 - 90^oC, в соотношении сырье : растворитель 1:5, смесь фильтруют, отделяют осадок сырья, экстракты объединяют, осаждают гиалуроновую кислоту 1 - 2%-ным водным раствором уксусной кислоты, осадок растворяют в дистиллированной воде в соотношении осадок : растворитель 1:2, подщелачивают раствором едкого натра до значения pH 7,0 - 7,3 и медленно подогревают до 80 - 90^oC, фильтруют, фильтрат лиофилизируют. 3 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Способ получения гиалуроновой кислоты, предусматривающий экстракцию измельченных петушиных гребней и выделение целевого продукта, отличающийся тем, что проводят двухстадийную экстракцию сырья физиологическим раствором при 80 90^oС, экстракты объединяют, гиалуроновую кислоту осаждают 1 2%-ным водным раствором уксусной кислоты, осадок заливают дистиллирвоанной водой, подщелачивают раствором едкого натра, нагревают до 80 90^oС, полученный раствор фильтруют, фильтрат лиофилизируют. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что экстракцию проводят при соотношении сырье: растворитель 1 5. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что осадок растворяют в дистиллированной воде при соотношении осадок растворитель 1 2. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что осадок подщелачивают до значения pH 7,0 7,3.