СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 1998 года по МПК C08B37/08 

Изобретение относится к химии природных высокомолекулярных соединений, принадлежащих к классу мукополисахаридов, конкретно, к способам получения /выделения/ гиалуроновой кислоты из природного сырья.

Гиалуроновая кислота представляет собой с химической точки зрения биополимер, построенный из повторяющихся звеньях D-глюкуроновой кислоты и N-ацетилглюкозамино-2-ацетамид-2-дезокси-D-глюкозы с глюкозидными связями β 1 → 3- и β 1 → 4- типов. Природными источниками гиалуроновой кислоты служат пупочные канатики, трахеи, стекловидное тело глаз, синовиальная жидкость убойных животных, гребни домашней птицы (петухов). В последние годы получили развитие способы выделения гиалуроновой кислоты из микроорганизмов (бактерий) и искусственно измененным генетическим аппаратом.

На протяжении многих десятилетий эта кислота привлекает к себе самое пристальное внимание в силу присущих ей свойств, чрезвычайно ценных с точки зрения, в частности медицины: гиалуроновая кислота успешно применяется для заживления ран, при кератитах, язвах и ожогах роговицы в офтальмологической практике, для лечения трещин заднего прохода в проктологии, при болезнях сосудов, с целью облегчения заживания вялогранулирующих ран и трофических язв, а также во многих других случаях.

Известно большое число способов получения (выделения) гиалуроновой кислоты. Имеется, например, охотно цитируемый в литературе, снабженный обширной библиографией патент США N 4141973 (НКИ: 514-54; опубл., 1979), описывающий ультрачистую гиалуроновую кислоту и многообразные аспекты ее практического использования. Согласно этому патенту, ультрачистую (< 0,5% белка), высокомолекулярную гиалуроновую кислоту (мол. 1,2 млн. Дальтон), способную до известной степени возмещать частичную утрату стекловидного тела у мартышек, получают из обескровленных петушиных гребней, которые промывают холодной водой из крана, замораживают до (-20) - (-40)^oC, разрезают на кусочки и заливают 95%-ным спиртом, содержащим хлороформ в качестве бактериостатика. После 24-часового встряхивания спирт декантируют и заменяют его свежей порцией /4 л спирта на 1 кг сырья/; встряхивание повторяют в течение следующих 48 ч, и гребни выдерживают в 95%-ном спирте при 4-22^oC в течение еще 2-х лет [1]. Целевой продукт выделяют из обескровленного сырья экстракцией смесью вода-хлороформ 20: 1 в течение 24 ч. Добавление к экстракту твердого хлорида натрия (до 10%) и затем хлороформа (до соотношения между ним и водой, равного 1:1) приводит к получению двух фаз;pH водной фазы устанавливают на уровне 4,0-5,0 соляной кислотой, отмывают от белка хлороформом, водную фазу подщелачивают 0,1 H NaOH до pH 6,0-7,0, отмывают хлороформом от фракций, вызывающих раздражение глаз, стерильно фильтруют и кислоту осаждают спиртом. Очевидно, применение такого метода, насчитывающего три критические стадии, может быть оправданным лишь для сугубо специфических случаев (офтальмология). С целью упрощения процедуры выделения обезбелоченное сырье согласно заявке ЕВП 239335 кл. C 08 B 37/08, 1987 промывают бутиловым спиртом, кислоту осаждают при обработке цетилпиридинийхлоридом или гексадецилтриметиламмонийбромидом, осадок растворяют в додецилсульфате натрия и продукт осаждают спиртом. В соответствии с заявкой ФРГ 4004001, кл. C 08 B 37/08, 1990 гиалуроновую кислоту (в виде Na-соли), используемую в косметических композициях, выделяют из животного сырья экстракцией ацетоном, экстракт обрабатывают папаином, ультрафильтруют, продукт осаждают цетилпиридинийхлоридом, осадок реэкстрагируют водным раствором NaCl, повторно ультрафильтруют и продукт осаждают спиртом. Среди недостатков приведенных выше способов можно назвать низкий выход продукта, необходимость использования легковоспламеняющихся органических растворителей и экзотических реактивов (солей четвертичного аммония, несущего длинные органические радикалы). В авт. св. СССР 950735, кл C 08 B 37/08 приведен способ выделения гиалуроновой кислоты из пупочных канатиков, которые после обезжиривания ацетоном заливают водой и оставляют в холодильнике на 10 ч до набухания, затем их гомогенизируют и нагревают на кипящей водяной бане 5-15 мин. По охлаждении примеси отделяют центрифугированием (15 мин, 6000 об. мин и продукт осаждают ацетоном из недостаточной жидкости. Из 2000 мг сырья получают 280 мг смеси, содержащей 205 мг кислоты и 75 мг белка с характеристической вязкостью 3,0 для 0,25%-ного раствора, что свидетельствует о низкой молекулярной массе.

По способу, изложенному в [3], петушиные гребни экстрагируют 5-25%-ным водным раствором бутилового спирта/изо-, трет- или нормального/, к экстракту прибавляют NaCl до расслоения фаз и кислоту осаждают спиртом, причем процесс выделения требует 32-х часов, а выход в описании не указан. Согласно патенту [2] фарш из петушиных гребней экстрагируют водой или 1-15%-ным водным раствором NaCl при 80^oC; выход кислоты 2%, содержание белка 9%, продолжительность выделения примерно 24 ч. По способу, изложенному в патенте США 4879375, кл. 536/55.1, опубл. 1989, для выделения гиалуроновой кислоты из синовиальной жидкости телят ее выдерживают одну неделю при 5^oC, фильтруют через стекловату, к фильтрату прибавляют NaCl до концентрации 2 М и затем - 2%-ный раствор уксусной кислоты в спирте; осадок растворяют в фосфатном буфере /pH 7/ и белок гидролизуют трипсином 2 ч при 37^oC в присутствии 0,05 М NaN₃. Продукт осаждают NaCl (до концентрации 2 М) и 2%-ной уксусной кислотой в спирте. Содержание белка 0,5%. Недостатки: низкий выход, большая трудоемкость. Согласно авт. св. СССР 1616926, кл. C 08 B 37/08, гребни петухов экстрагируют водой, выдерживают 1-2 мин при 90-100^oC, охлаждают 2-4 ч до 4-6^oC, фильтруют, фильтрат обрабатывают углем 1-2 ч и выдерживают 18-24 ч в присутствии пенициллина. ПО способу (патент Российской Федерации 2046801, кл. C 08 B 37/08, 1995) гребни петухов экстрагируют водой при 20-22^oC в три стадии при соотношении между сырьем и экстрагентом 1:/4-6/ и продукт осаждают трихлоруксусной кислотой.

В выбранном в качестве наиболее близкого аналога-прототипа способе получения гиалуроновой кислоты [1] гребни петухов, предварительно обезжиренные смесью спирта и хлороформа (встряхивание 3-4 раза с 2-мя объемами указанной смеси), экстрагируют 5 объемами воды, подкисленной до pH 3-4, при 90-100^oC в течение 1 ч, белки из экстракта удаляют активированным углем и затем диэтиламиноэтилцеллюлозой, фильтруют последовательно через бумажные, стеклянные, ацетилцеллюлозные и поливинилхлоридные фильтры и лиофилизацией получают 1,2% продукта, содержащего менее 0,1% белка.

Описанный способ, несмотря на его достоинства все же не лишен недостатков, к которым можно отнести следующие.

Способ довольно длителен и трудоемок предлагает использование органических растворителей, включая потенциальный канцероген-хлороформ. По данному способу приходится работать с большими объемами воды в качестве экстрагента. Кроме того, необходимы тонкодисперсные порошки угля и диэтиламиноэтилцеллюлозы, которые способны забивать фильтры и затруднять их регенерацию. Способ предполагает применение особых стеклянных фильтров /фрит/, а также специальных ацетилцеллюлозных и поливинилхлоридных фильтров.

Цель изобретения - создание способа получения гиалуроновой кислоты, лишенного перечисленных недостатков, обеспечивающего высокий выход и чистоту продукта, более простого в аппаратурном оформлении, а также не отличающегося длительностью.

Поставленная цель достигается благодаря тому, что в способе получения гиалуроновой кислоты, включающем экстракцию обескровленных, промытых и измельченных петушиных гребней /или пупочных канатиков/ и последующее пропускание экстракта через фильтры, измельченное сырье замораживают до (-20) - (-70)^oC, прибавляют 2 части воды и проводят одновременно с размораживанием экстрацию при 95 - 100^oC в течение 15 - 25 мин, экстракт собирают, осадок отделяют и замораживают до (-20) - (-70)^oC, прибавляют 1,5 части воды, экстрагируют 15-25 мин при 95 - 100^oC с одновременным размораживанием, осадок отделяют и три раза повторяют с ним цикл замораживания - экстрактивного размораживания, каждый раз с одной частью воды (на массу осадка). Из объединенных фильтратов гиалуроновую кислоту осаждают уксусной кислотой, дополнительно очищают ультрафильтрацией и воду удаляют в процессе лиофильной сушки.

Пример. 1 кг обескровленных гребней половозрелых петухов тщательно промывают водой, имеющей температуру 10-15^oC, измельчают на мясорубке до состояния фарша и замораживают до (70)^oC, прибавляют 2 мас. ч. (на сырье) воды, нагревают 15-25 мин. при 95-100^oC, фильтруют через 3 слоя марли (или альтернативно подвергают центрифугированию), осадок и фильтрат собирают, осадок замораживают до (-20) - (70)^oC и нагревают с полутора мас. ч. воды (на осадок) 15-25 мин при 95-100^oC, фильтруют через марлю, фильтрат собирают, а со вновь полученным осадком трижды повторяют процедуру замораживания-экстракции, используя каждый раз 1 массовую часть воды. Фильтраты объединяют и продукт выделяют при подкислении уксусной кислотой. Выход гиалуроновой кислоты составляет 50 г (5%), содержание балка (по методу Лоури) - менее 4%, молекулярная масса - около 1 млн. Дальтон (вычислено на основании величины характеристической вязкости). Гомогенность продукта подтверждена при излучении эффекта Тиндаля. Для дополнительной очистки от белка продукт растворяют в разбавленном растворе NaOH и подвергают ультрафильтрации с последующей лиофильной сушкой), что лишь незначительно сказывается на суммарном выходе продукта (примерно 4,5%), но позволяет снизить содержание белка в 10 раз.

Изобретение относится к способам выделения гиалуроновой кислоты из природного сырья. Обескровленное, промытое водой и измельченное до состояния фарша сырье (петушиные гребни или пупочные канатики) замораживают до (-20) - (-70)^oC, прибавляют 2 мас. ч. воды, нагревают 15 - 25 мин при 95 - 100^oC, осадок отделяют фильтрованием или центрифугированием. Вновь образовавшийся осадок замораживают до (-20) -(-70)^oC, прибавляют 1,5 мас.ч.воды, нагревают 15 - 25 мин при 95 - 100^oC, осадок отделяют и три раза повторяют с ним процедуру замораживания - экстракции горячей водой. Экстракты объединяют, гиалуроновую кислоту осаждают при добавлении уксусной кислоты, очищают ультрафильтрацией и воду удаляют в процессе лиофильной сушки. Способ позволяет в 3 - 4 раза повысить выход конечного продукта.

Способ получения гиалуроновой кислоты, включающий промывание и экстракцию водой обескровленного и измельченного исходного сырья - гребней петухов или пупочных канатиков с последующей обработкой экстракта фильтрацией и выделением гиалуроновой кислоты известными методами, отличающийся тем, что предварительно промытое и измельченное сырье замораживают до минус 20 - минус 70^oC, прибавляют 2 мас.ч. воды (на сырье), экстракцию проводят одновременно с размораживанием, нагревая в течение 15 - 25 мин при 95 - 100^oC, осадок отделяют и замораживают до минус 20 - минус 70^oC, прибавляют 1,5 мас. ч. воды (на вновь образовавшийся осадок), экстрагируют с размораживанием в течение 15 - 25 мин при 95 - 100^oC, осадок отделяют и три раза повторяют с ним процедуру замораживания - экстрактивного размораживания, каждый раз с 1 мас.ч. воды (на массу осадков), экстракты, полученные после отделения осадков, объединяют и гиалуроновую кислоту осаждают при добавлении уксусной кислоты, очищают ультрафильтрацией и из готового продукта воду удаляют в процессе лиофильной сушки.