СРЕДА ДЛЯ СОЧЕТАННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОДУКЦИИ ЭКЗОТОКСИНА И КАПСУЛЫ BACILLUS ANTHRACIS Российский патент 1997 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к определению продукции экзотоксина и капсулы культурами сибиреязвенного микроба, и может быть использовано в лабораторном исследовании штаммов этого микроорганизма. В ходе исследования штаммов B.anthracis необходимо установить, являются ли они патогенными и какова степень их патогенности (вирулентность). Двумя основными факторами патогенности возбудителя сибирской язвы являются экзотоксин и капсула. Экзотоксин, кроме того, основной фактор иммуногенности бескапсульных авирулентных вакцинных штаммов. Поэтому, оценив продукцию экзотоксина и капсулы культурами сибиреязвенного микроба, можно получить полное представление о патогенности и иммуногенности штаммов.

Известна среда для обнаружения капсулы B anthracis однопроцентный бикарбонатный агар, который содержит питательный агар и 1% бикарбоната натрия (1).

Недостатком этой среды является невозможность продукции и выявления экзотоксина.

Известна R-среда для продукции антигенов токсина B.anthracis (2). Состав среды следующий, г/л L-аргинина гидрохлорид 0,125; L-аспарагиновая кислота 0,184; L-валин 0,173; L- гистидина гидрохлорид 0,055; глицин 0,065; L-глутамат натрия 0,612; L-изолейцин 0,170; L-лейцин 0,230; L-лизин 0,230; L-метионин 0,073; L-пролин 0,043; L-серин 0,235; L-треонин 0,120; L-тирозин 0,144; L-триптофан 0,035; L-фенилаланин 0,125; L-цистин 0,025; аденина сульфат 0,0021; урацил 0,0014; тиамина гидрохлорид 0,001; CaCl₂•2H₂O 0,0074; MgSO₄•H₂O 0,0099; MnSO₄•H₂O 0,0009; K₂HPO₄ 3,0; NaHCO₃ 8,0; глюкоза 2,5. Эта среда обеспечивает продукцию экзотоксина, недостатком среды является невозможность ее выявления.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является агар для иммунологического исследования, который содержит R-агар (плотный вариант вышеописанной жидкой R-среды), и антисыворотку к спорам штамма B.anthracis Sterne в соотношении 12 к 2 (3). Определяемый на основании расчета состав среды-прототипа следующий, г/л: L-аргинина гидрохлорид 0,107; L-аспарагиновая кислота 0,157; L-валин 0,100; L-гистидина гидрохлорид 0,047; глицин 0,056; L-глутамат натрия 0,524; L-изолейцин 0,146; L-лейцин 0,197; L-лизин 0,197; L-метионин 0,062; L-пролин 0,037; L-серин 0,201; L-треонин 0,102; L-тирозин 0,123 L-триптофан 0,030; L-фенилалнин 0,107; L-цистин 0,021; аденина сульфат 0,0018; урацил 0,0012; тиамина гидрохлорид 0,00086; CaCl₂•2H₂O 0,0063; MgSO₄•H₂O 0,0085; MnSO₄•H₂O 0,00077; K₂HPO₄ 2,57; NaHCO₃ 6,86; глюкоза 2,14; антисыворотка к спорам штамма B.anthracis Sterne 142 мл; вода до 1 л. Эта среда дает возможность выявлять продукцию токсина и капсулы и по существу наиболее близка к заявляемой.

Среда прототип имеет следующие недостатки. При засеве на среду спор B. anthracis рост отсутствует или слабо выражен, что не позволяет определять продукцию экзотоксина и капсулы. Однако, для корректного количественного анализа клеточного состава культур сибиреязвенного микроба необходимо использовать именно споровые взвеси. Это связано с особенностями роста возбудителя сибирской язвы, вегетативные клетки которого соединены в цепочки, образующие конгломераты, в силу чего колониеобразующей единицей являются не одна клетка, как в случае использования спор, а неопределенное количество клеток. Поэтому среда-прототип не подходит для количественного анализа клеточного состава культур B.anthracis по признакам продукции экзотоксина и капсулы.

Среда также не обеспечивает адекватного роста штаммов с дополнительными питательными потребностями и не дает возможности определять у них продукцию экзотоксина и капсулы.

Кроме того, среда имеет низкую чувствительность, выражающуюся в слабой различимости колец иммунопреципитации вокруг колоний и слоя капсульного вещества на их поверхности. Поэтому на ней надежно выявляется продукция экзотоксина и капсулы только у штаммов с высоким уровнем их экспрессии. Определение затруднено или невозможно у штаммов со средним и низким уровнями экспрессии экзотоксина и капсулы, даже если штаммы не нуждаются в дополнительных факторах роста и используются вегетативные клетки.

Целью предлагаемого изобретения является расширение возможностей и повышение чувствительности определения продукции экзотоксина и капсулы B. anthracis.

Поставленная цель достигается тем, что среда для сочетанного определения продукции экзотоксина и капсулы B.anthracis (СОПЭК) включает l-аргинин•HCl, l-аспаргиновую кислоту, l-валин, l-гистидин•HCl, глицин, l-глутамат натрия, l-изолейцин, l-лейцин; l-лизин, l-метионин, l-пролин, l-серин, l-треонин, l-тирозин, l-триптофан, l-фенилаланин, l-цистин, аденин, урацил, тиамин•HCl, d(+)глюкозу, CaCL₂, MgSO₄•7H₂O, MnSO₄•5H₂O, K₂HPO₄•3H₂O, NaHCO₃, источник антитоксических антител, агарозу, воду дистиллированную, дополнительно содержит l-аланин и FeSO₄•7H₂O, а в качестве источника антитоксических антител содержит противосибиреязвенный глобулин жидкий, при следующем количественном соотношении ингредиентов, г/л: l-аланин 0,035-0,070; l-аргинин•HCl 0,200-0,250; l-аспарагиновая кислота 0,250-0,370; l-валин 0,240-0,350; l-гистидин•HCl 0,074-0,110; глицин 0,090-0,130; l-глутамат натрия 0,820-1,230; l-изолейцин 0,230-0,340; l-лейцин 0,300-0,460; l-лизин 0,300-0,460; l-метионин 0,100-0,150; l-пролин 0,060-0,090; l-серин 0,310-0,470; l-треонин 0,160-0,240; l-тирозин 0,200-0,300; l-триптофан - 0,047-0,070; l-фенилаланин 1,170-0,250; l-цистин 0,034-0,050; аденин 0,003-0,004; урацил 0,002-0,003; тиамин•HCl 0,00l-0,0015; CaCl₂ 0,008-0,012; MgSO₄•7H₂O 0,026-0,032; MnSO₄•H₂O 0,002-0,003; FeSO₄•7H₂O 0,002-0,003; K₂HPO₄•3H₂O 3,920-4,000; NaHCO₃ 8,0-100,0; d(+)глюкоза 2,3-2,7; агароза 10,0-15,0; противосибиреязвенный глобулин жидкий 75-100 мл; вода дистиллированная до 1 л pH готовой среды 8,0.

По отношению к прототипу у заявляемого изобретения имеются следующие отличительные признаки. Дополнительное введение в состав среды в качестве способствующих прорастанию и питательных веществ l-аланина и FeSO₄•7H₂O, использование в качестве источника антитоксических антител противосибиреязвенного глобулина жидкого, изменение концентрации питательной основы среды.

Изобретение осуществляется следующим образом. Среду СОПЭК готовят путем растворения в 400-425 мл дистиллированной воды ингредиентов, которые берут в соотношении, г:
l-аланин 0,035-0,070
l-аргинин•HCl 0,200-0,250
l-аспаргиновая кислота 0,250-0,370
l-валин 0,240-0,350
l-гистин•HCl 0,074-0,110
Глицин 0,090-0,130
l-глутамат натрия 0,820-1,230
l-изолейцин 0,230-0,340
l-лейцин 0,300-0,460
l-лизин 0,300-0,460
l-метионин 0,100-0,150
l-пролин 0,060-0,090
l-серин 0,310-0,470
l-треонин 0,160-0,240
l-тирозин 0,200-0,300
l-триптофан 0,047-0,070
l-фенилаланин 0,170-0,250
l-цистин 0,034-0,050
Аденин 0,003-0,004
Урацил 0,002-0,003
Тиамин•HCl 0,001-0,0015
CaCl₂ 0,008-0,012
MgSO₄•7H₂O 0,026-0,032
MnSO₄•H₂O 0,002-0,003
FeSO₄•7H₂O 0,002-0,003
K₂HPO₄•3H₂O 3,920-4,000
NaHCO₃ 8,0-10,0
d(+)глюкоза 2,3-2,7
Контролируют pH среды и при необходимости доводят его до 8,0. Полученный раствор питательной основы среды стерилизуют путем фильтрования через мембранный фильтр с диаметром пор 0,22-0,45 мкм.

Навеску агарозы 10-15 г расплавляют в 500 мл дистиллированной воды и стерилизуют автоклавированием при 121^oC в течение 20 мин. К расплавленной и охлажденной до 50^oC агарозе добавляют стерильно раствор питательной основы в объеме 400-425 мл и противосибиреязвенный глобулин жидкий в объеме 100-75 мл, перемешивают и разливают в чашки Петри по 10-12 мл.

Пример 1.Готовили в соответствии с прописями 4 среды.

1 cреда-аналог, однопроцентный бикарбонатный агар. 10 г питьевой соды растворяли в 100 мл стерильной дистиллированной воды при легком подогревании на пламени спиртовки, затем в 100 мл расплавленного и охлажденного до 50^oC питательного агара добавляли 10 мл полученного 10%-ного содового раствора и разливали в чашки Петри.

2 среда прототип, агар для имммунологического исследования. Указанные в описании навески ингредиентов среды растворяли в 358 мл дистиллированной воды, доводили pH до 8,0, стерилизовали полученный раствор фильтрованием через мембранный фильтр "Миллипор" с диаметром пор 0,22 мкм, стерильно добавляли 142 мл антисыворотки к спорам штамма Sterne и смешивали с 500 мл расплавленной и охлажденной до 50^oC стерильной агарозы, разливали в одноразовые чашки Петри по 14 мл.

3 предлагаемая среда СОПЭК с минимальными заявляемыми концентрациями ингредиентов. Их навески растворяли в 425 мл дистиллированной воды, доводили pH до 8,0, фильтровали через мембранный фильтр "Миллипор", стерильно добавляли 75 мл противосибиреязвенного глобулина жидкого, смешивали с 500 мл расплавленной и охлажденной до 50^oC стерильной 2%-ной агарозы, разливали в одноразовые чашки Петри по 10-12 мл.

4 предлагаемая среда СРПЭК с максимальными заявляемыми концентрациями ингредиентов. Их навески растворяли в 400 мл дистиллированной воды, фильтровали через мембранный фильтр, стерильно добавляли 100 мл противосибиреязвенного глобулина жидкого, смешивали с 500 мл расплавленной и охлажденной до 50^oC стерильной 3%-ной агарозы, разливали в одноразовые чашки Петри по 10-12 мл.

Подсохшие чашки со средами использовали для посевов.

Тест-штаммами B.anthracis служили штаммы с разными питательными потребностями и уровнями экспрессии экзотоксина и капсулы:
1. 81/1 не имеющий дополнительных питательных потребностей, со средним уровнем экспрессии экзотоксина и капсулы.

2. 30/86 не имеющих дополнительных питательных потребностей, с низкими уровнями экспрессии экзотоксина и капсулы.

3. 34F₂ Sterne не имеющий дополнительных питательных потребностей, с высоким уровнем экспрессии экзотоксина, бескапсульный.

4. 14/41 с дополнительными потребностями в аминокислотах, низким уровнем экспрессии экзотоксина и высоким капсулы.

5. 228 с дополнительными потребностями в аминокислотах, не продуцирующий экзотоксин, с высоким уровнем экспрессии капсулы.

6. 12/16-1 с дополнительными потребностями в аминокислотах, не продуцирующий токсин, бескапсульный.

В качестве посевного материала использовали: взвесь спор в дистиллированной воде; взвесь вегетативных клеток в физиологическом растворе, полученную суспендированием материала из 18- часовых агаровых культур сибиреязвенного микроба. Готовили взвеси спор и вегетативных клеток указанных штаммов с такой концентрацией колониеобразующих единиц, чтобы при высеве 0,1 мл из них на чашке формировалось 20-50 колоний.

Посевной материал засевали на 5 чашек с каждой из 4 сред, чашки помещали в анаэростат, из которого откачивали 25% воздуха и замещали его углекислым газом. Посевы инкубировали при 37^oC в течение 48 ч, а затем переносили в холодильник и выдерживали 48 ч при 6^oC. По окончании этого срока учитывали результаты. Для этого оценивали рост, определяли средние размеры колоний в чашках с одной средой. Продукцию экзотоксина определяли по наличию белых концентрических колец иммунопреципитации в среде вокруг колоний. Наличие и выраженность токсинообразования устанавливали визуально, просматривая чашки на темном фоне, и микроскопически под малым увеличением микроскопа с объективом 8. Об экспрессии экзотоксина судили также по удалению колец от края колоний, принимая удаление прямо пропорциональным степени экспрессии экзотоксина. Продукцию капсулы определяли визуально по наличию на поверхности колоний слизистого блестящего слоя капсульного вещества и микроскопически в мазах, сделанных с колоний и окрашенных по Ребигеру, пользуясь объективом 90 с иммерсией.

Пример 2. Готовили предлагаемую среду МОПЭК по той же прописи и технологии, что и в примере 1 (3-й вариант). В качестве посевного материала использовали взвеси спор тех же штаммов и засевали по 10-25 чашек на каждый штамм. Инкубацию посевов проводили так же, как в примере 1. По окончании инкубации подсчитывали общее количество колоний, количество колоний, окруженных кольцами иммунопреципитации (продуцирующие экзотоксин), количество колоний, покрытых слоем капсульного вещества (продуцирующие капсулу), и определяли процентное отношение тех и других к общему числу колоний на всех чашках для каждого штамма.

Сравнительные результаты определения продукции экзотоксина и капсулы на предлагаемой среде СОПЭК и средах аналоге и прототипе приведены в таб.1.

Эти результаты показывают, что на среде- аналоге можно определить только продукцию капсулы у всех штаммов, обладающих этим свойством, однако, невозможно определить продукцию экзотоксина. На среде-прототипе можно визуально определить продукцию экзотоксина и капсулы у штаммов с высоким (34F₂ Sterne) и средним (81/1) уровнем экспрессии этих признаков. У штамма 30/86 с низким уровнем экспрессии этих факторов можно определить их продукцию только микроскопически. Выявление экзотоксина и капсулы возможно только при использовании в качестве посевного материала вегетативных клеток, причем лишь у штаммов 34F₂ Sterne 81/1 и 30/86, не имеющих дополнительных питательных потребностей, тогда как штаммы с дополнительными потребностями (228, 14/41 и 12/16-1) на этой среде не растут и поэтому определить у них продукцию капсулы и экзотоксина не представляется возможным. В отличие от аналога и прототипа на предлагаемой среде СОПЭК можно определить продукцию капсулы и экзотоксина у всех штаммов, обладающих этими свойствами, визуально, независимо от питательных потребностей штаммов и используемого посевного материала.

Как показали результаты экспериментов и опытных испытаний, заявленные количества компонентов в среде необходимы и достаточны для достижения поставленной цели.

Результаты количественного определения содержания продуцирующих экзотоксин и капсулу колониеобразующих единиц в культурах сибиреязвенного микроба приведены в табл.2.

Из данных табл. 2 видно, что культуры штаммов отличались по содержанию продуцирующих капсулу и экзотоксин единиц, при этом содержание колебалось от почти 100% у штамма 81/1 до 0 у штамма 12/16-1.

Результаты, приведенные в примерах, получены экспериментально в ходе испытаний в лабораторных условиях.

Таким образом, предлагаемая среда для сочетанного определения продукции экзотоксина и капсулы сибиреязвенного микроба расширяет возможности и повышает чувствительность определения. В отличие от известных сред на ней можно определять одновременно продукцию как экзотоксина, так и капсулы у всех существующих штаммов, при использовании любого посевного материала. Способность обеспечивать продукцию факторов патогенности при засеве спор дает возможность применять ее также по новому назначению, а именно для количественного анализа популяционного состава культур B.anthracis по признакам продукции экзотоксина и капсулы.

Список литературы:
Бургасов П.Н. Рожков Г.И. Сибиреязвенная инфекция. М. Медицина, 1984, с. 208.

Использование: биотехнология, микробиология, экзотоксин и капсула сибиреязвенного микроба, исследование штаммов. Сущность изобретения состоит в том, что среда на основе R-агара для иммунологического исследования содержит в качестве способствующих прорастанию спор и питательных веществ дополнительно L-аланин и сульфат железа, а в качестве антитоксических антител - противосибиреязвенный глобулин, при определенных количественных отношениях ингредиентов. Такой состав среды обеспечивает сочетанное одновременное определение продукции экзотоксина и капсулы при использовании в качестве посевного материала не только вегетативных клеток, но и спор, как у штаммов с обычными питательными потребностями и уровнями экспрессии факторов, так и у штаммов с дополнительными потребностями в аминокислотах, с низким уровнем экспрессии экзотоксина и капсулы. Эти свойства среды дают возможность дифференцировать по вирулентности все существующие штаммы, отбирать иммуногенные вакцинные штаммы, проводить анализ клеточного состава культур B.anthracis по признакам продукции экзотоксина и капсулы. 2 табл.

Среда для сочетанного определения продукции экзотоксина и капсулы Bacillus anthracis, состоящая из L-аргинина•HCl, L-аспарагиновой кислоты, L-валина, L-гистидина•НСl, глицина, L-глютамата натрия, L-изолейцина, L-лейцина, L-лизина, L-метионина, L-пролина, L-серина, L-треонина, L-тиpoзина, L-триптофана, L-фенилаланина, L-цистина, аденина, урацила, тиaминa•HCl, α(+) глюкoзы, CaCl₂, MgSO₄•7H₂O, MnSO₄•5H₂O, K₂HPO₄•3H₂O, NaHCO₃, источника антитоксических антител, агарозы, воды дистиллированной, отличающаяся тем, что дополнительно она содержит L-аланин и FeSO₄•7H₂O, антитоксических антител противосибиреязвенный глобулин жидкий при следующем соотношении ингредиентов, г/л:
L-аланин 0,035 0,070
L-аргинин•HCl 0,200 0,250
L-аспарагиновая кислота 0,250 0,370
L-валин 0,240 0,350
L-гистидин•HCl 0,074 0,110
Глицин 0,090 0,130
L-глютамат натрия 0,820 1,230
L-иэолейцин 0,230 0,340
L-лейцин 0,300 0,460
L-лизин 0,300 0,460
L-метионин 0,100 0,150
L-пролин 0,060 0,090
L-серин 0,310 0,470
L-треонин 0,160 0,240
L-тирозин 0,200 0,300
L-триптофан 0,047 0,070
L-цистин 0,034 0,050
L-фенилаланин 0,170 0,250
Аденин 0,003 0,004
Урацил 0,002 0,003
Тиамин•HCl 0,001 0,0015
CaCl₂ 0,008 0,012
MgSO₄•7H₂O 0,026 0,032
FeSO₄•7H₂O 0,002 0,003
MnSO₄•7H₂O 0,002 0,003
K₂HPO₄•3H₂O 3,920 4,000
NaHCO₃ 8,000 10,000
α(+)глюкоза 2,300 2,700
Агароза 10,000 15,000
Противосибиреязвенный глобулин жидкий 0,075 0,1 л
Вода дистиллированная До 1 лт