Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в биотехнологии получения сибиреязвенных медико-биологических препаратов.
Принципиальная технологическая схема получения фага включает добавление в бульонную культуру специального производственного фага, размножение при 37oC в течение суток, фильтрацию и проверку на чистоту, стерильность и активность (К.Д. Пяткин, Ю.С. Кривошеин, Микробиология, М., "Медицина", 1980, с. 108).
Известен способ выращивания сибиреязвенного бактериофага Гамма, предусматривающий последовательное получение вегетативной культуры и специфическое лизирование культуры в жидком питательном бульоне Хоттингера с добавлением в него активирующих добавок (з. РФ N 96123389/13, C 12 N 7/00//C 12 N 1/20).
Способ осуществляется следующим образом. Готовят питательную среду из бульона Хоттингера, добавляют в нее дрожжевой экстракт 2,5 г/л, 3 мл/л 10% раствор кальция хлористого, устанавливают pH в пределах 7,4. Питательная среда засевается взвесью спор сибиреязвенного вакцинного штамма 55 из расчета 6-10 млн. спор на 1 мл среды. Культивирование проводят при встряхивании в течение 5-6 ч, затем вносят препарат маточного фага Гамма из расчета 1-2 мл на 100 мл бульонной культуры. Проводят инкубацию посевов при 37oC в течение 24 ч. Препарат фильтруют на установке "Millipore" с применением стерилизующих фильтров. По Аппельману определяют специфичность и активность готового продукта. Фаг имеет высокую концентрацию - 109.
При достаточной простоте и кратковременности процесса (30 ч) этот способ нерационально применять в биотехнологии диагностического препарата из-за его высокой себестоимости за счет использования дорогостоящего животного сырья в питательных средах. Кроме того, фаг в жидком виде недостаточно стабилен, срок его годности составляет 6-12 месяцев.
Известен способ, выбранный прототипом получения сибиреязвенного фага Гамма путем его культивирования на комбинированной плотной среде, для которой использовался 2% агар и жидкий перевар Хоттингера, в который на 1 л добавляли 20 мг триптофана, по 100 мг хлористого магния и сульфата магния и 5 г глюкозы. Использовали препараты фагов γ и K исходной концентрацией 6 • 108 и 1 • 108 соответственно. В качестве вегетативной культуры чувствительный клон штамма B.anthracis N 303 (Н.А. Кузьмин, Б.А. Комаров, Лабораторное дело N 12, 1967, с. 741-743).
Режим выращивания включает засев 12-14-часовой агаровой культуры, смытой с косяка переваром Хоттингера, на матрас с плотной средой. После 6-7 ч инкубации на газон подливают перевар Хоттингера с внесенным в него маточным фагом с титром 108 - 109 м.к./мл. Процесс лизирования вегетативной культуры проводят в термостате при 37oC в течение 16-17 ч. Затем лизат из матраса центрифугируют со скоростью 5-6 тыс. об/мин в течение 6 мин и супернатант фильтруют через асбестовые пластинки аппарата Зейтца.
Способ обеспечивает получение фага с титром не менее 1010. При оптимальном показателе множественности инфекции для фага на штамме N 303, 0,35 урожайность достигает 100-400 фаговых частиц на одну бактериальную клетку.
Недостатком способа является многоступенчатость и использование дорогого животного сырья, что существенно осложняет его промышленное производство.
В жидком виде препарат недостаточно стабилен.
Целью изобретения является достижение технологичности способа, обеспечивающего снижение себестоимости препарата в промышленном производстве, повышение стабильности при сохранении высоких показателей по выходу продукта, специфической активности и биологических свойств.
Поставленная цель достигается тем, что способ получения сибиреязвенного бактериофага включает выращивание вегетативной культуры на плотном питательном агаре Хоттингера в течение 14-18 ч, специфическое лизирование культуры в жидкой синтетической среде путем одновременного суспендирования культуры и маточного бактериофага и инкубирование взвеси в течение 5-10 ч, фильтрование и стабилизацию готового продукта методом лиофильного высушивания в защитной среде в течение 18-20 ч.
Среда SM для специфического лизирования культуры содержит 5,8 г/л NaCl, 2 г/л MgSO4; 7H2O, 5 мл/л 2% желатина, 50 мл/л 1 M трис-буферного раствора с pH 7,5 (Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук, Молекулярное клонирование, М., Мир, 1984, с. 497).
Защитная среда для лиофильного высушивания продукта содержит 1,5 г желатина и 20 г сахарозы на 100 мл дистиллированной воды.
Известно использование аналогичной защитной среды при лиофильном высушивании умеренных холерных фагов (А.с. СССР N 1296578, C 12 N 7/00, 1/04, от 15.03.87, Бюл. 310).
Бактериофаг смешивают с защитной средой в соотношении 1:2, предварительное замораживание осуществляют в течение 3-4 мин, в охлажденном до минус 55oC этиловом спирте, а высушивание проводят в течение 26-27 ч.
Существенным отличительным признаком заявляемого способа являются следующие. Получение вегетативной культуры на чашках с агаром Хоттингера позволяет отбирать типичные колонии сибиреязвенного микроба, что обеспечивает специфическую чистоту процесса лизирования и экономию дорогостоящей среды. Использование синтетической среды для лизирования вегетативной культуры позволяет получать стабильный выход бактериофага в высоких титрах и снижает себестоимость продукта. Жидкий препарат, полученный по этой технологии, является более чистым и может использоваться для получения антифаговой сыворотки, а также в генетических исследованиях. Стабилизация готового продукта методом лиофильного высушивания в защитной среде в течение 18-20 ч, обеспечивает увеличение срока годности готового препарата с 6-12 мес до 3-х лет.
Возможность практического использования изобретения подтверждается примером его конкретного выполнения.
Пример 1. Бактериологической петлей засевают газоном взвесь спор сибиреязвенного вакцинного штамма N 55 на чашку с агаром Хоттингера и инкубируют в термостате при 37oC 18 ч.
Готовят синтетическую питательную среду.
Трис 11,1 растворяют в 100 мл дистиллированной воды, доводят концентрацию HCl pH до 7,5. 100 мг желатина растворяют в 5 мл воды. Навески 5,8 г NaCl, 2 г MgSO4 • 7H2O растворяют в 100 мл воды. 50 мл триса с pH 7,5 и остальные растворы соединяют, доводят общий объем до 1 л. Среду стерилизуют автоклавированием при 1 атм в течение 20 мин или фильтрованием через мембранные фильтры. В колбе со 100 мл жидкой среды суспендируют 3 бактериологических петли вегетативной культуры и добавляют 10 мл бактериофага Гамма А-26 с титром не менее 107. Смесь перемешивают, колбы помещают в термостатируемую качалку и инкубируют при 37oC в течение 5-10 ч в зависимости от просветления лизата.
Препарат стерилизуют через мембранные фильтры с диаметром пор 0,25-0,45 мкм на установке "Millipore". По методу Аппельмана в модификации Грациа определяют литическую активность и специфичность готового препарата. Титр бактериофага составляет 109.
Приготовляют защитную среду для лиофильного высушивания препарата. В 100 мл дистиллированной воды растворяют 1,5 г желатина и 20 г сахарозы, автоклавируют при 1 атм 30 мин.
К готовому жидкому бактериофагу добавляют приготовленную защитную среду в соотношении 1:1 и направляют на лиофильное высушивание.
Предварительное замораживание осуществляют в морозильной камере при минус 40oC в течение 6-8 ч. Лиофильное высушивание проводят в вакуумсушильной установке ТГ-5 в течение 18-20 ч. При этом температуру постепенно повышают в течение 6 ч от минус 40oC до 0oC, в течение 5 ч от 0oC до 10oC, 5 ч от 10oC до 25oC и 2 часа при постоянной температуре. Рабочее давление в камере - 30 Па. Ампулы с готовым продуктом запаивают на газокислородной горелке.
Таким образом, изобретение практически осуществимо, его использование в биотехнологии позволит организовать промышленный выпуск высококонцентрированных сибиреязвенных диагностических бактериофагов Гамма А-26 с длительным сроком хранения.
Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в биотехнологии получения сибиреязвенных медико-биологических препаратов. Для снижения себестоимости препарата - сибиреязвенного бактериофага, повышения его стабильности при сохранении необходимых биологических свойств вегетативную культуру сибиреязвенного микроба выращивают на плотном агаре Хоттингера в течение 14-18 ч, специфическое лизирование культуры осуществляют в жидкой синтетической среде путем одновременного суспендирования культуры и маточного бактериофага и инкубирования взвеси в течение 5-10 ч с последующей фильтрацией и лиофильным высушиванием готового продукта в защитной среде в течение 18-20 ч.
Способ получения сибиреязвенного бактериофага, включающий культивирование вегетативной культуры на плотной питательной среде, пересев, инкубацию в присутствии фага, фильтрацию и стерилизацию полученного лизата, отличающийся тем, что вегетативную культуру пересевают в жидкую синтетическую среду с одновременным добавлением маточного бактериофага, инкубируют 5-10 ч, а полученный стерилизованный фильтрат лизата стабилизируют методом лиофильного высушивания в защитной среде в течение 18-20 ч.
| RU 96123389 A, 20.03.1999. |
