СПОСОБ ОТБОРА ИММУНОГЕННЫХ ШТАММОВ И СУБКУЛЬТУР ЖИВЫХ СИБИРЕЯЗВЕННЫХ ВАКЦИН Российский патент 1998 года по МПК C12Q1/04 C12N1/20 A61K39/07 C12Q1/04 C12R1/07 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и иммунологии, в частности, к разработке, производству и контролю качества живых сибиреязвенных вакцин.

Основным фактором, определяющим иммуногенность сибиреязвенного микроба, является его экзотоксин. Все современные живые сибиреязвенные вакцины представляют собой бескапсульные токсинопродуцирующие штаммы. Показано, что не продуцирующий токсин, лишенный плазмиды токсинообразования pX01 вариант вакцинного штамма 34F₂ Sterne, неиммуногенен [1,2]
Наиболее близким к изобретению является способ отбора иммуногенных сибиреязвенных вакцинных штаммов, заключающийся в однократной иммунизации морских свинок несколькими дозами изучаемых культур с заражением через 21 день иммунизированных животных и последующим исчислением индекса иммунитета в сравнении с референс-вакциной СТИ-1 [3]
Недостатками этого способа являются низкая эффективность, связанная с тем, что исследованию подлежат все бескапсульные культуры, включая не продуцирующие токсин, которые заведомо не могут быть иммуногенными, а также с тем, что получившие отрицательный результат культуры исключаются из дальнейшего исследования как бесперспективные.

Были подтверждены экспериментальные данные других авторов об абсолютной необходимости продукции токсина для иммуногенности и установлено, что разные вакцинные штаммы и их субкультуры, выращенные на агаре для иммунологического исследования, содержащем антитоксические антитела, различаются по относительному количеству колониеобразующих токсинопродуцирующих единиц (Tox⁺KOE) в клеточной популяции культуры. При этом степень их иммуногенности, определенная по индексу иммунитета для морских свинок, прямо коррелирует с количеством Tox⁺KOE.

Целью изобретения является повышение эффективности способа отбора иммуногенных штаммов и субкультур живых сибиреязвенных вакцин и уменьшение расхода лабораторных животных.

Цель достигается тем, что способ отбора иммуногенных штаммов и субкультур включает однократную иммунизацию морских свинок несколькими дозами изучаемых культур с заражением через 21 день иммунизированных животных возбудителем сибирской язвы с последующим исчислением индекса иммунитета в сравнении с референс-вакциной, причем перед иммунизацией животных в изучаемых культурах определяют продукцию экзотоксина in vitro и по относительному количеству Tox⁺KOE отбирают неимммуногенные при значениях 1-10% низкоиммуногенные при 11-63% и иммуногенные при 64-100% с последующей селекцией в популяциях низко- и неиммуногенных культур иммуногенных клонов с получением из них субкультур. Таким образом, отбор производится более целенаправленно, чем в способе-прототипе.

По отношению к прототипу у изобретения имеются следующие отличительные признаки. Дополнительное введение определения токсинообразования культур in vitro, отбор по относительному количеству Tox⁺KOE неиммуногенных при значениях 1-10% низкоиммуногенных при 11-63% и иммуногенных 64-100% культур, селекция в популяциях низко- и неиммуногенных культур иммуногенных клонов, получение субкультур этих клонов.

Изобретение осуществляется следующим образом. Агар для иммунологического исследования, содержащий антитоксические антитела (RYE) [4] готовят путем растворения в 358 мл дистиллированной воды ингредиентов, которые берут в соотношении, г:
1-Аргинин•HCl 0,125
1-Аспарагиновая кислота 0,184
1-Валин 0,137
1-Гистидин•HCl 0,055
Глицин 0,065
1-Глутамат натрия 0,612
1-Изолейцин 0,170
1-Лейцин 0,230
1-Лизин 0,230
1-Метионин 0,073
1-Пролин 0,043
1-Серин 0,235
1-Треонин 0,120
1-Тирозин 0,144
1-Триптофан 0,035
1-Фенилаланин 0,125
1-Цистин 0,025
Аденин 0,0021
Урацил 0,0014
Тиамин•HCl 0,001
CaCl₂•2H₂O 0,012
MgSO₄•H₂O 0,0099
MnSO₄•H₂O 0,0009
K₂HPO₄ 3,000
NaHCO₃ 8,000
d(+)глюкоза 2,500
Дрожжевой экстракт 8,000
Контролируют pH среды и при необходимости доводят его до 8,0. Полученный раствор питательной основы среды стерилизуют путем фильтрации через мембранный фильтр с диаметром пор 0,22-0,45 мкм. Навеску агарозы 15 расплавляют в 500 мл дистиллированной воды и стерилизуют автоклавированием при 121^oC в течение 20 мин. К расплавленной и охлажденной до 50^oC агарозе добавляют стерильно раствор питательной основы в объеме 358 мл и баранью антисыворотку против спор сибиреязвенного вакцинного штамма 34F₂ в объеме 142 мл, перемешивают и разливают в чашки Петри по 10-12 мл.

Готовят десятикратные разведения спор вакцинных штаммов сибиреязвенного микроба на дистиллированной воде до разведения 10^-7. Засевают по три чашки с агаром Хоттингера из разведений 10^-5, 10^-6 и 10^-7 по 0,1 мл споровой взвеси на каждую. Посевы инкубируют в течение 18 ч при 37^oC, подсчитывают число выросших колоний на чашках и определяют среднее число колоний для каждого разведения. Для засева чашек с RYE используют разведение, которое обеспечивает при засеве из него формирование 25-50 изолированных колоний на чашках с агаром Хоттингера.

Взвеси спор изучаемых штаммов по 0,1-0,2 мл на чашку засевают на 10-20 чашек RYE Для контроля качества среды засевают также приготовленную аналогично взвесь спор референс-препарата вакцины СТИ-1. Чашки, содержащие посевы, помещают в микроанаэростат или CO₂-инкубатор. Из микроанаэростата вакуумным насосом откачивают 25% воздуха, ориентируясь на показания мановакуумметра, и замещают его углекислым газом. В CO₂-инкубаторе чашки культивируют с 10% углекислого газа. Посевы инкубируют при 37^oC в течение 48 ч, затем переносят чашки из микроанаэростата или CO₂-инкубатора в холодильник и выдерживают там в течение 3 сут при температуре 4^oC.

Токсинообразование выявляют по методу [4] Для выявления токсинообразования чашки с RYE просматривают при естественном освещении на черном фоне, пользуясь для этого листом черной бумаги. Вокруг продуцирующих токсин колоний в среде формируются концентрические ореолы иммунопреципитации в виде тонких белых колец. Не продуцирующие токсин колонии лишены таких ореолов. Подсчитывают общее число колоний (не менее 500), число колоний с ореолами иммунопреципитации и их процентное содержание.

Если процентное содержание колоний с ореолами иммунопреципитации составляет 1-10% то культура оценивается как неиммуногенная; при содержании колоний 11-63% культура оценивается как низкоиммуногенная; 64-100% - соответствует иммуногенной культуре.

Среди колоний культур с недостаточной иммуногенностью отбирают колонии, окруженные ореолами иммунопреципитации и пересевают их на пробирки с бульоном Хоттингера. Посевы культивируют при 37^oC в течение 18 ч и пересевают на матрасы с агаром Гладстона-Филдса. Последние культивируют при 32^oC в течение 7-10 дней. На седьмой день делают мазки с матрасов, окрашивают их по Ребигеру и микроскопируют, определяя степень спорообразования. Если степень спорообразования достигает 95-100% споры смывают дистиллированной водой, готовят взвеси спор, определяют процентное содержание в них токсинопродуцирующих КОЕ, как описано выше, и отбирают субкультуры, содержащие 64-100% токсинопродуцирующих КОЕ. Из спор отобранных штаммов и субкультур готовят взвеси с содержанием 10⁶ спор в 0,5 мл и такими дозами иммунизируют подкожно по 30 морских свинок массой 320-350 г на каждую культуру. Через 21 сут каждую из групп животных заражают подкожно сибиреязвенным тест-штаммом 71/12 дозами 10², 10³, 10⁴, 10⁵ и 10⁶ спор по 6 животных на каждую дозу. В качестве контроля этим же штаммом заражают 30 невакцинированных морских свинок подкожно в объеме 0,5 мл дозами 10, 10², 10³, 10⁴, 10⁵ и 10⁶ по 6 животных на дозу. Через 10 сут подсчитывают число выживших животных от каждой заражающей дозы и определяют LD₅₀ для вакцинированных и невакцинированных морских свинок по Риду-Менчу. Вычисляют индекс иммунитета, который равен отношению LD₅₀ заражающего штамма для вакцинированных штаммов к LD₅₀ этого же штамма для невакцинированных животных. Параллельно по этой же методике определяют индекс иммунитета для референс-штамма вакцины СТИ-1. Отбирают как иммуногенные те культуры, индекс иммунитета которых равен или превышает индекс иммунитета референс-препарата.

Пример 1. Готовили споровые взвеси референс-препарата вакцины СТИ-1, четырех вариантов вакцинного штамма 228/8 и пяти бескапсульных вариантов штамма 228, селекционированных в качестве возможных новых вакцин, при высеве из которых на чашках с агаром Хоттингера формировалось 25-50 колоний. Готовили чашки с RYE в соответствии с прописью и засевали каждый из вариантов на 10-20 чашек, посевы помещали в анаэростат, из которого откачивали 25% воздуха и замещали его углекислым газом. Посевы инкубировали при 37^oC в течение 48 ч, затем чашки извлекали из анаэростата и переносили в холодильник, выдерживали при 4^oC в течение 3 сут, после чего просматривали чашки при естественном освещении на темном фоне, пользуясь листом черной бумаги. Подсчитывали общее число колоний, число колоний, окруженных ореолами иммунопреципитации и определяли их процентное содержание для каждого из вариантов. Готовили взвеси с содержанием 10⁶ спор в 0,5 мл для всех вариантов и такими дозами иммунизировали подкожно по 30 морских свинок массой 320-350 г на каждую культуру. Через 21 сутки каждую из групп животных заражали подкожно сибиреязвенным тест-штаммом 71/12 дозами 10², 10³, 10⁴, 10⁵ и 10⁶ спор по 6 животных на каждую дозу. В качестве контроля этим же штаммом заражали 30 невакцинированных морских свинок подкожно в объеме 0,5 мл дозами 10, 10², 10³, 10⁴, 10⁵ по 6 животных на дозу. Через 10 сут подсчитывали число выживших животных от каждой заражающей дозы и определяли LD₅₀ для вакцинированных и невакцинированных морских свинок по Риду-Менчу. Вычисляли индекс иммунитета, который равен отношению LD₅₀ заражающего штамма для вакцинированных штаммов к LD₅₀ этого же штамма для невакцинированных животных. Параллельно по этой же методике определяли индекс иммунитета для референс-штамма вакцины СТИ-1. Результаты приведены в табл.1.

Пример 2. Проводили отбор иммуногенных штаммов и их субкультур среди 18 испытуемых штаммов и серий вакцин в соответствии с приведенными выше описаниями предлагаемым способом и способом-прототипом. Сравнительные результаты определения приведены в табл.2.

Из табл.1 видно, что выбранные интервалы значений процентного содержания колоний с иммунопреципитацией соответствуют оценке иммуногенности штаммов, получаемой in vivo. Интервал 1-10% соответствует неиммуногенным штаммам, так как их индекс иммунитета составляет 1-2, что не превышает разброса в пределах одного порядка и может отражать разброс значений LD₅₀ заражающего штамма при нескольких определениях.

Промежуточный интервал 11-63% соответствует низкоиммуногенным штаммам, индекс иммунитета которых больше 10, но меньше индекса иммунитета референс-препарата. Эти штаммы обеспечивают защиту от заражения только части взятых в опыт животных. В интервал 64-100% колоний с иммунопреципитацией укладываются все те штаммы, индекс иммунитета которых равен или превышает индекс иммунитета референс-штамма СТИ-1 и которые по определению относятся к иммуногенным.

Таким образом, интервал процентного содержания колоний с иммунопреципитацией, формирующихся на СОПЭК, прямо коррелирует с индексом иммунитета вакцинных штаммов и может быть использован как критерий для отбора иммуногенных штаммов и их субкультур in vitro.

Данные, приведенные в табл.2, показывают, что с использованием предлагаемого способа можно отобрать 17 иммуногенных штаммов и субкультур сибиреязвенных вакцин, в то время как в способе-прототипе отбор ограничивается девятью штаммами, а отбор иммуногенных субкультур неиммуногенных штаммов оказывается невозможным. При этом расходуется одинаковое количество лабораторных животных по 540 морских свинок. Штамм Sterne v2 представляет собой культуру отобранного нами в популяции иммунгенного штамма STERNE неиммуногенного клона, в популяции которого не содержится токсинопродуцирующих КОЕ и взят в качестве отрицательного контроля. Если задача сводится только к отбору иммуногенных штаммов, то в этом случае для отбора тех же 9 штаммов предлагаемым способом потребуется вместо 540 только 270 морских свинок. Таким образом, в любом случае предлагаемый способ оказывается вдвое более эффективным, чем способ-прототип. Особенно эффективен заявляемый способ при проверке иммуногенности штаммов, у которых ранее определялся индекс иммунитета, например, у серий вакцины по истечении срока хранения, поскольку в этом случае можно ограничиться первым этапом определения опытом in vitro, и тогда для этого потребуется только 180-360 чашек RYE вместо 540 морских свинок. Кроме того, если иммуногенность в процессе хранения снизилась, ее можно повысить, отобрав иммуногенную субкультуру in vitro, что недостижимо другими способами.

Следовательно, предлагаемый способ отбора иммуногенных штаммов и субкультур сибиреязвенных вакцин имеет более высокую эффективность, чем существующий способ, и позволяет использовать его по новому назначению для повышения иммуногенности вакцин.

Источники тоформации
1. Uchida I. Hashimoto К. Terakado N. Virulence and immunogenicity in experimental animals of Bacillus anthracis strains harboring or lacking 110 Mda and 60 Mda plasmids//J.Gen. Microbiol.-1986.-Vol.132. P.557-559.

2. Welkos S.L. Friedlander A.M. Comparative safety and efficacy against Bacillus anthracis of protective antigen and live vaccines in mice//Microbiol.Pathogenesis. 1988. Vol.5. P.127-139.

3. Основные критерии отбора сибиреязвенных вакцинных штаммов для изготовления живых сибиреязвенных вакцин для иммунизации людей. М.1982.

4. Ivins В.Е. Welkos S.L. Cloning and expression of Bacillus anthracis protective antigen gene in Bacillus subtilis//lnfect.and Immun. 1986. Vol. 54.

Использование: медицинская микробиология, иммунология, отбор иммуногенных штаммов и субкультур, контроль качества, живые сибиреязвенные вакцины. Сущность изобретения состоит в том, что способ включает предварительную количественную оценку иммуногенности популяции изучаемых культур по относительному количеству токсинопродуцирующих колониеобразующих единиц in virto на агаре для иммунологического исследования. При этом из дальнейшего исследования иммуногенности in vivo исключаются низко- и неиммуногенные культуры. Затем производится отбор иммуногенных культур, селекция в популяции низкоиммуногенных и неиммуногенных культур иммуногенных клонов, получение из них субкультур для последующего подтверждения их иммуногенности и окончательного отбора in vivo. Способ позволяет вдвое повысить эффективность отбора или вдвое сократить расход экспериментальных животных, а также увеличивать иммуногенность субкультур. 2 табл.

Способ отбора иммуногенных штаммов и субкультур живых сибиреязвенных вакцин, заключающийся в однократной иммунизации морских свинок несколькими дозами изучаемых культур с заражением через 21 день иммунизированных животных и последующим исчислением индекса иммунитета в сравнении с референс-вакциной, отличающийся тем, что перед иммунизацией животных в изучаемых культурах определяют продукцию экзотоксина in vitro и по относительному количеству Тох⁺ КОЕ отбирают неиммуногенные при значениях 1 10% низкоиммуногенные при 11 63% и иммуногенные при 64 100% с последующей селекцией в популяцих низко- и неиммуногенных культур иммуногенных клонов с получением из них субкультур.