сл
с
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для диагностики микоплазм-контаминантов в культурах клеток. Штамм получают слиянием клеток миеломы мышей SP2/0-Ag с клетками селезенки мышей BALB/C, иммунизированных мембранным антигеном M.arglnini. Клетки растут на среде ДМЭМ с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, 1 мМ пирувата натрия, 2% глутамина, 100 мкг/мл стрептомицина и 100 ед/мл пенициллина, частота пассирования 1-2 сут, индекс рассева V2-V3. Клетки продуцируют Мои AT, специфичные к антигену Mycoplasma arginini, титр Мои AT в иммуноферментном тесте составляет 1-128-1 256
14
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для диагностики микоплазм-контаминантов в культурах клеток
Штамм получают следующим образом
Клетки миеломы мышей SP2/0-Ag сливают с клетками селезенки мышей BALB/C иммунизированных четырехкратно (100 мкг) мембранным антигеном M.arginmi, выделенным из культур клеток.
Сливание клеток проводят через 3 дня после последней внутривенной иммунизации с помощью ПЭГ-4 000. Клетки миеломы и спленоциты смешивают в соотношении 1:5-1:10 по общепринятой методике
Селекцию гибридом проводят на среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и ти- мидин.
Гибридомы выращивают на 96-луноч- ных плашках на среде ДМЭМ с 10% феталь14
й тм
я аыи
е, и-
ч- ьной сыворотки крупного рогатого скота в атмосфере с 5% СОг.
Тестирование гибридом на продукцию антител проводят методом ИФА с использованием антимышиных конъюгатов, а также. мембранного антигена препаратом микбгТ- лазм М arginini.
Реклонирование проводят на плашках по общепринятой методике. В результате отбирают и размножают клон, продуцирующий моноклональные антитела, которые реагируют с антигеном М.arginini.
В иммуноферментном тесте перекрестные реакции с другими штаммами микоп- лазм отсутствуют.
Положительный клон клеток последовательно размножают в 96, 24, 12-луночных плашках, а затем в чашках Петри.
Культуральную жидкость исследуют на содержание специфических антител Титр
о. сл
N) 00 СО Ю
специфических антител в иммунофермент- ном тесте составляет 1:128-1:256.
Препараты моноклональных антител получают 3-кратным осаждением раствором сульфата аммония 50%-ного насыще- ния с последующим диализом. Определяют классовую принадлежность и специфичность моноклональных антител.
Штамм клеток обладает следующими свойствами.
Морфологические признаки. Клетки ок- руглой формы с большим ядром, слабо прикрепляются к субстрату, размножаются в суспензии.
Культуральные свойства. Клетки растут на среде ДМЭМ с добавлением 10% фетэль- ной сыворотки крупного рогатого скота, 1 мМ пирувата натрия, 2% глутамина, 100 мкг/мл стрептомицина и 100 ед/мл пенициллина. Характер роста - стандартная сус- пензия.
Частота пассирования 1-2 сут, индекс рассева 1:2-1:3.
Контаминация. Контаминантов - бактерий, грибов, дрожжей и микоплазм - не об- наружено.
Моноклональные антитела определены как иммуноглобулины М-класса.
Хранение культур. Суспензию клеток в концентрации не менее 5 « 106 в ампуле за- мораживают в среде, содержащей 10% ди- метилсульфоксида, 45% среды ДМЭМ инактивированной фетальной сыворотки крупного рогатого скота. Режим замораживания - снижение температуры на 1 град в 1 мин. Выживаемость клеток после размораживания 60%.
Штамм получил название ШГК. МрА. А-1 и депонирован в Институте цитокологии АН СССР под номером ВСКК(П) № 329D.
П р и м е р 1. Клетки клона пассируют на среде ДМ ЭМ с 10% сыворотки эмбриона коровы, 1 мМ пирувата натрия в атмосфере с 5% С02.
Титр специфических антител в культу- ральной жидкости в ИФА составят 1.128- 1:256.
П р и м е р 2. Клетки продуцирующего клона вводят о брюшную полость мышам линии BALB/c, предварительно за 10 сут праймированным 0,5 мл пристана, по 2«10б клеток в 0,5 миллилитровом фосфатно-соле- вом растворе.
На 14 сут получена асцитнап жидкость титр специфических антител в ИФА 0,5-1,0- 106.
П р и м е р 3. Препараты моноклональных антител, полученных из асцитной и культуральной жидкостей высаливанием сульфатом аммония 50%-ного насыщения, коньюгируют с пероксидазой из хрена пе- рийодатным методом в соотношении 1 1 (вес/вес). Рабочее разведение конъюгата в ИФА с использованием в качестве мембранного антигена M.arginini (100 мкг/лунку) составляет 1:6400. Реакция на другие штаммы микоплазм в ИФА соответствует уровню контроля с неспецифическим белком.
Формула изобретения
Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musQulus 1,ВСКК(П) № 329D - продуцент моноклональных антител к мембранному антигену Mycoplasma argininl.
