ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИНА Российский патент 1997 года по МПК B01D15/08 A61K38/00 

Изобретение относится к области биологической химии, в частности к хроматографическому выделению альфа-фетопротеина из биологических жидкостей и тканей.

Известен способ выделения альфа-фетопротеина из абортивного материала путем его обработки бутиловым спиртом, диализа против буферного раствора, аффинной хроматографии на иммобилизованных экстрогенах и элюирования смесью бутилового спирта и буферного раствора [1]
Недостатком способа является невысокая степень чистоты препарата (95%).

Наиболее близким по техническим сущности и достигаемому результату является хроматографический способ выделения альфа-фетопротеина из фетального материала, включающий его очистку и колоночную хроматографию в три стадии. На первой стадии проводят аффинную хроматографию на колонке с цианбромированной сефарозой ковалентно связанной с овечьими антителами против альфа-фетопротеина человека с элюацией альфа-фетопротеина глицин солянокислыми буфером при изменении pH до 2, 6, вторую стадию проводят на колонке с голубой сефарозой с элюацией 2 M NaCl, а третью стадию поводят на колонке с Con-A-сефарозой, уравновешенной ацетатным буфером с фракционной элюацией альфа-фетопротеина раствором метил-альфа-Д-глюкопираназаида с градиентом концентраций. Далее собирают 23-27-ю фракции, содержащие альфа-фетопротеин [2]
Недостатком данного способа является невысокий выход целевого продукта 20% поскольку элюирование ведется фракционно.

Задачей настоящего изобретения является разработка хроматографического способа выделения альфа-фетопротеина высокой степени чистоты из фетального материала человека с повышенным выходом целевого продукта.

Поставленная цель достигается описанным способом хроматографического выделения альфа-фетопротеина, включающим предварительную очистку биологического фетального материала путем осаждения раствором сульфата аммония и колоночную хроматографию в четыре стадии, на первой стадии на колонке, заполненной цианбромированной сефарозой иммобилизованной поликлональными антителами животных, например, кроликов, овец, коз, мышей против альфа-фетопротеина человека с элюацией альфа-фетопротеина раствором карбоната натрия, на второй стадии на колонке с ионообменной диэтиламиноэтил сефарозой уравновешенной натрий-фосфатным буфером при элюации раствором ацетатного буфера и нейтрализации элюата раствором гидроксида натрия, на третьей стадии - на колонке, заполненной цианбромированной сефарозой иммобилизированной антителами животных против белков нормальной сыворотки человека при элюации раствором карбоната натрия, а на четвертой стадии вновь на колонке с ионообменной диэтиламиноэтил сефарозой уравновешенной натрий-фосфатным буфером при элюации раствором хлорида натрия, содержащий натрий-фосфатный буфер и сахарозу.

После проведения колоночной хроматографии продукт можно заморозить и лиофильно высушить для хранения.

В качестве исходного материала рекомендуется использовать абортальную или плацентарную сыворотки или пуповинную кровь.

Пример осуществления способа. Предварительную очистку проводят с помощью фракционирования белков сыворотки осаждением 1,3 M раствором сульфата аммония. После выделения осадка на центрифуге (40 мин 8000g) супернатанат разводят в 3 раза забуференным физиологическим раствором и пропускают через колонку (3,0 x 10 см, скорость подачи 500 мл/ч) с имуносорбентом, который представляет собой ковалентно связанные с BrCN-активированной сефарозой CL-4B поликлональные антитела кролика против альфа-фетопротеина человека. Перед нанесением колонку промывают сначала 0,01 M раствором HCL, затем уравновешивают забуференным физиологическим раствором, pH 7,4. Затем колонку промывают сначала буферным раствором, содержащим 0,5 M хлорида натрия и физиологическим раствором хлорида натрия (0,9%) до тех пор, пока оптическая плотность выходящего из колонки раствора не снизится до 0,005 оптических единиц. После пропускания раствора через колонку альфа-фетопротеин элюируют с помощью 1% раствора углекислого натрия (pH 11,3). Профиль элюции контролируют спектрофотометрически, при 280 нм. После снятия белка с колонки pH раствора снижают до pH 7,4, добавляя 1N раствор HCL. Объем снятой с аффинной колонки альфа-фетопротеина составлял 2 объема иммуносорбента с титром 1/128, что соответствует концентрации белка 0,5 мг/мл.

Полученный раствор альфа-фетопротеина (АФП) разбавляют в 2,5 раза дистиллированной водой и концентрируют на колонке с ДЕАЕ-сефарозой, уравновешенной 0,02 M натрий-фосфатным буфером, pH 7,4. Затем колонку промывают 0,02 M фосфатным буфером, pH 6,2. Белок с колонки элюируют 0,1 M раствором ацетатного буфера, pH 4,5. Элюат нейтрализуют 1N раствором гидроокиси натрия до pH 7,4.

Далее проводят третью стадию колоночной хроматографии очистку от примеси ("негативная" иммуносорбция). Для того, чтобы очистить выделенный альфа-фетопротеин от возможных следовых количеств белков сыворотки, полученный раствор белка наносят на аффинную колонку с антителами кролика против нормальной сыворотки человека. Элюацию ведут раствором карбоната натрия.

Далее раствор АФП после очистки от примесных белков разбавляют в 3 раза и концентрируют на колонке с ДЕАЕ-сефарозой, уравновешенной 0,02 M натрия-фосфатным буфером, pH 7,4. Колонку тщательно промывают 0,02 M фосфатным буфером и проводят элюцию с использованием 0,3 M раствора хлорида натрия, содержащий 0,02 M натрий-фосфатного буфера и 5% сахарозы. Конечная концентрация альфа-фетопротеина составила 20 мг/мл. Сразу после получения конечного продукта его замораживают и сушат лиофильно.

Таким образом получен альфа-фетопротеин с выходом из исходного сырья примерно 30% чистотой 99%
Контроль качества выделенного АФП. Для контроля качества полученного препарата проводили гельхрамотографию на TOYOPEARL HW-55 (200 x 12 мм, проба
10 мг), предварительно диализовав раствор АФП против 0,005 M натрий-фосфатного буфера, pH 7,4.

Таком образом предложенное изобретение позволяет выделить альфа-фетопротеин из фетального биологического материала последовательным применением иммунно-аффинной хроматограффии на BrCN-сефарозе и ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-сефарозе. Иммунно-аффинная хроматография включает в себя иммуносорбицию на поликлональных антителах животных против альфа-фетопротеина человека, и иммуносорбцию на антителах животных белков нормальной сыворотки человека.

За счет двухстадийной иммуносорбции и двухстадийной ионообменной сорбции получен препарат высокой степени чистоты с высоким выходом целевого продукта.

Использование: в области хроматографического разделения с помощью иммуносорбентов. Сущность: предложен способ выделения альфа-фетопротеина из биологического материала человека - путем осаждения и четырехступенчатой хроматографии, 1-ая и 3-ая ступень которой проводится на аффинных иммуносорбентах, а 2-ая и 4-ая на ионообменной ДЕАЕ-сефарозе. 3 з.п. ф-лы.

1. Хроматографический способ выделения альфа-фетопротеина, включающий предварительную очистку исходного биологического фетального материала и многостадийную колоночную хроматографию, отличающийся тем, что предварительную очистку проводят путем осаждения раствором сульфата аммония, а хроматографию ведут в четыре стадии, на первой стадии на колонке, заполненной цианбромированной сефарозой, иммобилизованной поликлональными антителами животных против альфа-фетопротеина человека с элюацией альфа-фетопротеина раствором карбоната натрия, на второй стадии на колонке с ионообменной диэтиламиноэтил сефарозой, уравновешенной натрийфосфатным буфером при элюации раствором ацетатного буфера и нейтрализацией элюата раствором гидроксида натрия, на третьей стадии на колонке, заполненной цианбромированной сефарозой, иммобилизованной антителами животных против белков нормальной сыворотки человека, при элюации раствором карбоната натрия, а на четвертой стадии вновь на колонке с ионообменной диэтиламиноэтил сефарозой, уравновешенной натрийфосфатным буфером, при элюации раствором хлорида натрия, содержащего натрийфосфатный буфер и сахарозу. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что после колоночной хроматографии продукт замораживают и сушат лиофильно. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве биологического фетального материала используют абортальную или плацентарную сыворотку или пуповинную кровь. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве антител животных используют антитела кроликов, овец, коз, мышей.